论文部分内容阅读
作为世界上的第二大玉米生产国,我国玉米的种植面积和产量不断增加,目前已超过水稻成为中国的第一大粮食作物。中国玉米生产长期处于自给自足的平衡状态,2010年、2012年中国先后成为玉米净进口国,我国在玉米进出口关系上的转变,使提高国内玉米产量的任务更加紧迫。玉米生长处于高温、高湿季节,杂草危害严重,化学除草是消除杂草危害、保证玉米增产增收的重要除草方式。草甘膦作为目前使用范围最广的灭生性除草剂,在杀死杂草的同时,对农作物同样具有杀死作用。通过植物基因工程育种使玉米获得草甘膦抗性,是解决这一矛盾的有效手段。本研究通过酶切连接法改造植物表达载体pCAMBIA3301-epsps,使抗草甘膦基因2mG2-epsps处于玉米泛素蛋白启动子之后,用农杆菌介导法转化玉米自交系18-599R及Hi-II幼胚,并对幼胚转化系统进行了优化,获得了T0代转基因植株。通过对转基因植株的PCR检测和测序验证,表明目的基因2mG2-epsps已整合到玉米基因组中。主要结果如下：1、植物表达载体pCAMBIA3301-epsps的改造。将pCAMBIA3301上草甘膦基因2mG2-epsps前的CaMV35S启动子换成玉米泛素蛋白启动子Ubiquitin启动子。作为玉米自身基因的启动子,用它驱动外源基因转化玉米时,可以降低外源基因在转基因个体中的拷贝数,从而避免基因沉默现象的发生。2、玉米幼胚作为遗传转化的外植体,通过影响出愈率来影响农杆菌介导玉米转化效率。本研究用0.8-2.0 mm大小的幼胚,在菌液浓度为OD600=0.4-0.6,浸染时间为10 min的条件下进行处理,恢复培养后统计出愈率。结果显示,0.8-1.2 mm、1.2-1.5 mm、1.5-2.0 mm时的出愈率分别为93%、74%、38%,证明幼胚的大小为0.8-1.5 mm时均可以作为农杆菌介导玉米遗传转化的受体。3、浸染后在恢复培养基中使用400mg/L的头孢来抑制农杆菌的继续生长,为保证抗性愈伤组织的形成,筛选培养基中同样需要添加头孢。实验中用200 mg/L、400mg/L、600mg/L的头孢进行处理,在1.2mmol/L草甘膦筛选培养基中筛选15天后统计抗性愈伤率,结果表明筛选培养基中仍使用400 mg/L的头孢才能保证较高的抗性愈伤率。4、菌液浓度、浸染时间及二者的交互作用均对浸染效率影响显著,按照两因素三水平设计9个处理,三次重复。实验结果显示,菌液浓度OD600=0.6,浸染时间为10 min时,1.5 mmol/L草甘膦筛选15天后的平均抗性愈伤率最高,为37.33%。菌液浓度为OD600=0.4时,可适当延长浸染时间来提高浸染效率。5、对18-599R和Hi-II幼胚的农杆菌介导法进行比较,结果发现Hi-II比18-599R更早形成愈伤,且愈伤组织增长速度更快,对草丁膦的筛选也更快作出反应。实验中获得78株18-599R再生植株,9株PCR检查呈阳性,阳性率为11.5%；获得18株Hi-II再生植株,5株PCR检查呈阳性,阳性率为27.8%。所以,Hi-II比18-599R更适合作为玉米遗传转化的受体材料,但授粉困难。选择合适的栽种条件,保证Hi-II幼胚的稳定供给,是其作为玉米遗传转化受体先决条件。6、转基因再生植株畸形现象严重,从实验室到大田条件变化大,植株长势弱,雌雄穗花期不协调,造成授粉困难,难以获得可育后代。实际中可通过姊妹杂交,或与亲本杂交来获得T1代种子。