众所周知,随着晚婚晚育现象的增多,雌性生育年龄较以前有一个非常大的延迟。但女性年龄的增加又会导致卵母细胞(亦称卵母细胞)质量的显著下降进一步影响生育力,所以如何提高女性特别是高龄女性卵母细胞质量是所有科研工作者面临的巨大挑战。另外由于人们物质水平的极大提升,肥胖的盛行日趋严重,与此同时肥胖所带来相关医学病态问题也多了起来。特别是肥胖对于人类生殖的影响很大程度上影响了肥胖人类的正常生活,已经有大量证据表明肥胖对于女性的生育力和妊娠均具有害影响。令人担忧的是很多研究表明肥胖对于卵母细胞的影响属于一种不可逆的伤害影响。特别是肥胖女性需要更长时间去怀孕,即使怀孕,相比于其他正常女性,也具有一个更高的流产率和出生后代的缺陷比率。如何降低肥胖对于女性生育力的影响具有着重要的意义。Sirtuin蛋白是一类组蛋白去乙酰基转移酶,NAD+为其辅酶。主要包括最初发现于酵母细胞中的Sir2和哺乳动物中的同源类似物Sirt1-Sirt7。从细菌到复杂的真核生物Sirtuin蛋白质家族均为高度保守,大量研究证实Sirtuin具有广泛的生理功能,并在抗衰老和延长寿命方面发挥重要的作用。在本试验中以雌性老化小鼠(45-58周龄)为模型,试图从分子水平去阐述老化卵母细胞的相关机理并一定程度地改善高龄雌性卵母细胞质量;以HFD小鼠(高脂饲料饲喂16周的雌性肥胖小鼠)为模型来研究Sirt3在母源性肥胖卵母细胞中的作用机制,从而为现在日趋严重的肥胖难题提供一种新方案和思路。此外,关于Sirtuin在猪卵母细胞成熟过程中的作用还鲜有报道,本研究以猪卵母细胞为研究材料,采用Sirtuin的特异性抑制剂NAM和Sirtinol探讨Sirtuin在猪卵母细胞减数分裂过程中的作用。试验一、Sirt2在小氯卵母细胞减数分裂过程中的作用本试验旨在采用显微注射Sirt2吗啉基(Sirt2 morpholino,Sirt2-MO)和Sirt2mRNA、Western blot、免疫荧光染色等方法研究Sirt2在小鼠卵母细胞减数分裂过程中的功能。通过激光共聚焦扫描,本试验结果显示GV期Sirt2均匀分布于卵母细胞的胞质中;随着减数分裂的进程Sirt2逐渐聚集在纺锤体区域,这表明Sirt2可能与纺锤体的形成或组装相关。在小鼠卵母细胞中特异性敲除Sirt2会影响卵母细胞第一极体(pb1)的排出(P<0.05);免疫荧光结果显示卵母细胞中Sirt2的敲减导致纺锤体的缺陷和染色体的结构破坏(P<0.05),并伴随着微管和动粒相互作用的损害。此外,为了进一步阐明Sirt2的敲减引起纺锤体等结构异常的原因。在本试验中选取了Sirt2潜在的作用靶蛋白进行免疫荧光染色和过表达试验。敲除和过表达试验表明Sirt2调节卵母细胞中H4K16和α-tubulin的乙酰化状态,这两种蛋白的乙酰化在一定程度上会通过影响微管动态和动粒功能来调节上述表型。最后通过Western blot检测发现老化小鼠的卵母细胞中Sirt2蛋白水平显著降低,并在老化小鼠卵母细胞中过表达Sirt2后,母源性年龄相关的减数分裂缺陷能有所改善(P<0.05),更加验证了我们的假设:Sirt2是众多导致卵母细胞年龄依赖性缺陷的因子之一。总之,试验表明Sirt2在卵母细胞减数分裂过程中发挥着积极的作用,并揭示了提高老化卵母细胞中Sirt2的表达shir对卵母细胞减数分裂具有显著的益处。试验二、Sirt3阻止卵母细胞中肥胖相关的氧化应激和减数分裂缺陷已经有报道表明母系肥胖能引起卵母细胞中氧化应激和减数分裂的缺陷,但是其潜在的分子机制到目前为止还不清楚。为了研究Sirt3在母系肥胖卵母细胞中的作用,本试验采用一个HFD饲喂的小鼠作为肥胖的模型(HFD饲喂小鼠16周),检测到HFD卵母细胞中ROS的增强和Sirt3表达的降低。通过显微注射Sirt3吗啉基(Sirt3 morpholino,Sirt3-MO)的方法特异性敲减卵母细胞中Sirt3致使细胞内ROS水平显著上升,与此同时Sirt3在HFD卵母细胞中的过表达又能一定的程度上降低卵母细胞中ROS的水平,并同时很显著地改善肥胖卵母细胞中报道的纺锤体组装紊乱和染色体排列杂乱的表型。这表明Sirt3在HFD卵母细胞中的下降是导致卵母细胞中ROS上升的主要原因。为了证实上述观点,根据赖氨酸被替换成谷氨酰胺模拟一个乙酰化的氨基酸状态,而替换成一个精氨酸模拟一个去乙酰化的氨基酸状态这一特性,采用点突变的方式构建了SOD2K68Q(一个SOD2高乙酰化的突变体)和SOD2K68R(一个SOD2低乙酰化的突变体)两个突变体。后续的试验表明SOD2K68乙酰化状态的维持取决于卵中的Sirt3,并且模拟的SOD2K68Q导致细胞内ROS接近3倍的增加。此外,试验发现HFD卵母细胞中SOD2K68的乙酰化水平增长约百分之八十,更为重要的是,低乙酰化的模仿体SOD2K68R能够挽救这些缺陷的表型。总的来说,本试验数据鉴定出Sirt3在卵母细胞的发育过程中是ROS稳态的重要的调节者,Sirt3依赖性的SOD2在母系肥胖环境中对体内氧化应激和减数分裂的缺陷具有着很重要的保护作用。试验三Sirtuin抑制剂阻止猪卵母细胞减数分裂进程在本试验旨在采用Sirtuin抑制剂nicotinamide(NAM)和Sirtinol来研究他们对猪卵母细胞成熟的影响。结果表明NAM和Sirtinol处理后降低了猪卵母细胞的体外成熟率及第一极体的排出率,并且伴随着颗粒细胞扩散的失败。表明Sirtuin可能参与猪卵母细胞成熟的过程。为了进一步弄清NAM和Sirtinol的抑制作用对减数分裂过程中卵母细胞的极性和纺锤体的结构的影响。利用免疫荧光染色的方法分别对肌动蛋白帽、无皮质颗粒区域(CGFD)和纺锤体及染色体进行分析。结果发现处理后的卵母细胞肌动蛋白帽和CGFD无法形成,并且出现显著的纺锤体异常如多极纺锤体和染色体排列不齐的表型如出现了很多分裂中滞后的染色体。这表明Sirtuin可能参与猪卵母细胞减数成熟过程中组织结构,上述的表型都将影响卵母细胞的受精力和接下来的胚胎发育,并最终影响子代的健康。总的来说,试验结果表明Sirtuins参与猪卵母细胞的减数分裂的进程,并可能对于接下来的发育具有重要的意义。