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目的阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)是神经系统常见的以认知障碍为特征的退行性疾病,以基底前脑胆碱能神经元的退变为主要的病理特征之一。β-淀粉样蛋白(amyloid protein,Aβ)是脑内细胞外老年斑的主要成份,其通过凋亡途径致细胞死亡在AD的神经元丢失中起重要作用。神经生长因子(nerve growth factor,NGF)为胆碱能神经元的重要营养因子,动物实验和体外细胞培养提示NGF能有效保护胆碱能神经元受损伤导致的神经变性,使NGF的潜在药物作用备受瞩目。NGF主要通过其高亲和性酪氨酸蛋白激酶受体TrkA介导其信号,与磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase, PI3-K)/蛋白激酶B(protein kinase B,PKB,Akt)途径、Ras-丝裂原激活蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK,ERK)途径间相互联系。该文旨在通过以β-淀粉样蛋白毒性片断Aβ25-35诱导大鼠嗜铬瘤细胞株PC12细胞凋亡建立体外AD细胞模型,研究从眼镜蛇毒分离的NGF是否有抗β-淀粉样蛋白致凋亡的作用并探讨可能的机制。通过应用TrkA受体信号通路激酶的特异阻断剂、检测caspase-3的活性及Bcl-2表达的变化,着重探讨NGF抗β-淀粉样蛋白致PC12细胞凋亡作用的相关信号转导通路,为阐明AD的发病机理及其预防和治疗提供实验依据。方法(1)应用Sephadex-G50凝胶层析、CM-Sepharose FF阳离子交换层析及Sephacryl S-200 High Resolution柱层析从中华眼镜蛇粗毒中分离纯化NGF,以PC12细胞生物活力测定为跟踪检测手段;应用SDS-PAGE和IEF-PAGE分别测定纯化NGF的分子量和等电点。(2)应用PC12细胞建立β-淀粉样蛋白诱导的细胞凋亡模型,以荧光显微镜观察细胞形态变化,DNA凝胶电泳,四唑氮蓝(MTT)法,乳酸脱氢酶(LDH)释放法,流式细胞术等检测凝聚态β-淀粉样蛋白毒性片断Aβ25-35诱导的PC12凋亡,同时检测蛇毒NGF干预下细胞的凋亡变化。(3)PI3-K/Akt、Ras/细胞外信号调节蛋白激酶(ERK1/2)途径是NGF受体后细胞增殖和分化调控的基本信号传导通路。为明确PI3-K/Akt、Ras/ERK是否参与NGF受体介导的抗β-淀粉样蛋白诱导PC12细胞凋亡的作用, Western-blot法检测NGF作用的PC12细胞胞浆的Akt、ERK1/2磷酸化活性变化,并应用PI3-K的特异抑制剂LY294002和ERK1/2的特异抑制剂PD98059分别调控其活性,流式细胞仪等观察应用抑制剂后对PC12细胞暴露Aβ25-35及NGF干预的细胞凋亡的变化,同时以Western-blot法测定细胞Bcl-2表达和caspase-3活性的变化。结果(1)NGF的纯化和特性:眼镜蛇粗毒经Sephadex G-50柱层析得到4个峰,经PC12细胞分化实验,鉴定第Ⅱ峰含NGF。浓缩第Ⅱ峰上CM-Sepharose FF阳离子交换柱,得到6个峰,其中第Ⅱ峰经鉴定为NGF组分。将第Ⅱ峰上Sephacryl S-200 HR柱进一步纯化,获得的第Ⅰ峰为NGF,经SDS-PAGE、IEF-PAGE鉴定,电泳结果都呈单一区带,测得分子量为24.5kD,等电点为8.23。纯化的NGF可诱导PC12细胞长出突起,向神经样细胞分化,有效浓度为10ng/mL,100ng/mL作用明显,细胞分化程度与NGF呈剂量及时间依赖效应。(2)蛇毒NGF抗β-淀粉样蛋白诱导的PC12细胞凋亡的作用: MTT法、LDH释放率显示凝聚态Aβ25-35对PC12细胞的毒性作用呈剂量依赖性;荧光显微镜观察20μmol/L Aβ25-35作用于PC12细胞48h,PC12细胞散在,出现核边缘化,核固缩、核碎裂、凋亡小体等凋亡改变; 20μmol/L Aβ25-35作用PC12细胞48h,出现较为典型的DNA梯带电泳。NGF预处理可保护PC12细胞的损伤,20μmol/L Aβ25-35作用组细胞LDH释放率随NGF作用的浓度增高而降低,细胞的形态有明显改善。流式细胞仪分析,Aβ25-35作用PC12细胞48h,对照组的凋亡率为2.1±0.3%,Aβ25-35作用使细胞凋亡率增加,10μmol/L及20μmol/L组凋亡率分别为9.3±0.5%和18.6±3.4%,具有剂量依赖关系。应用100ng/mLNGF预处理, 20μmol/L Aβ25-35组PC12细胞的凋亡率降低,为11.2±3.7%,差别有统计学意义。(3) PI3K/Akt信号途径在NGF抗Aβ25-35诱导PC12细胞凋亡的作用: Western blot结果显示,NGF能激活PC12细胞胞浆Akt的磷酸化,呈浓度和时间依赖关系。PI3K的特异抑制剂LY294002能特异抑制Akt的磷酸化,并呈剂量依赖性,对ERK1/2的磷酸化无抑制作用。100ng/mLNGF有对抗Aβ25-35引起的PC12细胞Bcl-2表达水平的下调和caspase-3活性升高的作用。以特异抑制剂20μmol/L LY294002预处理细胞,能部分消除100ng/mLNGF对Aβ25-35诱导PC12细胞凋亡的保护作用,同时下调Bcl-2的表达水平,升高caspase-3的活性。(4) Ras/ERK信号途径在NGF抗Aβ25-35致PC12细胞凋亡的作用: Western blot结果显示,NGF能明显激活PC12细胞胞浆ERK1/2的磷酸化,呈浓度和时间依赖关系。ERK1/2的特异抑制剂PD98059能特异抑制ERK1/2的磷酸化,并呈剂量依赖性,对Akt的磷酸化无抑制作用。预先应用ERK1/2的特异抑制剂20μmol/L PD98059对100ng/mLNGF抗Aβ25-35诱导的PC12细胞的凋亡作用未见明显改变,Bcl-2的表达水平及caspase-3的活性未见明显变化。结论(1)建立简单的分离方法,从眼镜蛇粗毒中分离获得电泳纯NGF,生物学活性良好,有利于正确评价天然来源NGF的作用。(2)凝聚态Aβ25-35对PC12细胞具有毒性作用,经形态学观察、DNA梯带电泳、流式细胞仪等分析,显示20μmol/L Aβ25-35能有效建立PC12细胞凋亡模型。(3)蛇毒来源的NGF有部分对抗Aβ25-35致PC12细胞凋亡的作用。(4 )眼镜蛇毒来源的NGF抗Aβ25-35诱导的PC12细胞凋亡的作用与PI3K/Akt途径相关,通过激活PI3K—→激活Akt—→上调Bcl-2的表达—→降低caspase-3激活—→抑制细胞凋亡。(5)本实验结果显示蛇毒来源的NGF抗Aβ25-35诱导的PC12细胞凋亡的作用与ERK途径间未见明显相关,抑制ERK1/2的活性,对细胞的凋亡无明显影响。综上所述,眼镜蛇毒来源的神经生长因子能部分对抗β-淀粉样蛋白毒性片断Aβ25-35诱导的大鼠嗜铬瘤PC12细胞的凋亡,与通过激活PI3-K/Akt途径并促进Bcl-2的表达和抑制caspase-3的激活相关。