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背景:ITLN是一种新发现的由内脏脂肪间质血管细胞分泌的蛋白,包括两种亚型:ITLN-1和ITLN-2。其中,人血浆循环的亚型是ITLN-1,而ITLN-2并未在血浆中检测到。ITLN-1参与维持机体代谢,有抗炎、抗动脉粥样硬化和心血管保护作用,并且与多种胃肠道肿瘤相关。研究发现ITLN-1通过ERK/NF-kB、JNK/AMPK和eNOS信号途径抑制血管内皮炎症,激活AMPK/Akt-eNOS信号通路刺激缺血诱导的血运重建,启动JNK/p53/bcl-2/caspase-3信号通路抑制人肝癌细胞增殖和诱导细胞凋亡等,但ITLN-1特异性受体、分子及细胞机制仍未见报道。CRISPR-Cas系统是以RNA引导的降解入侵病毒或噬菌体DNA的适应性免疫系统。通过对原核生物CRISPR-Cas系统进行改造,形成了以RNA引导的对靶细胞中特定的基因序列进行定点修饰的新一代基因编辑技术。该基因编辑技术已经应用各种疾病模型,研究疾病发生、发展的机制。目的:为进一步探索ITLN-1在脑血管中的作用,我们拟利用CRISPR-Cas9基因编辑技术对HUVECs细胞株中的ITLN基因进行敲减,并在HUVECs细胞株中过表达ITLN-1,观察ITLN-1对HUVECs细胞的增殖作用并初步筛选出其相互作用分子。方法:1.针对ITLN-1第二个外显子进行gRNA的设计,将配对的一对gRNA插入到px330载体中。将人胚肾细胞HEK 293细胞分为实验1组、实验2组、实验3组,成功构建的三种质粒分别转染至3组实验小组,转染48小时候提取基因组后测序,并用T7核酸内切酶验证三组质粒切割效率;2.将HEK 293细胞分为六组,分别转染5组过表达ITLN-1质粒及Vector组,转染后48小时提取培养基上清蛋白及细胞总蛋白,对蛋白采用还原方法和非还原方法处理后行Western Blot检测;3.将HUVECs细胞分为Control组、敲减组和过表达组,采用CCK8试剂盒检测HUVECs细胞增殖活性并进行数据分析;4.对HUVECs细胞蛋白进行Western Blot、免疫共沉淀实验,并对目的条带进行质谱分析及功能分析。结果:1.设计出三对针对ITLN-1的sgRNA,测序结果显示实验2组突变较明显,实验3组次之,实验1组最差;T7核酸内切酶验证三组切割效率,结果可见实验2组突变率达12%,实验3组突变率达7%,实验1组未见明显突变条带;2.Western Blot未检测到HEK 293表达ITLN-1蛋白;还原型ITLN-1分子量大小在34-43 kDa之间,非还原型ITLN-1分子量大小约在120 kDa;两种标签融合在ITLN-1的碳端时,ITLN-1表达量有下降;ITLN-1在胞外仅有一条带,而在胞内有两条带;3.相比于Control组,ITLN-1过表达组转染后12小时,HUVECs细胞增殖活性升高(~*P<0.05);敲减组较control组24小时,HUVECs细胞活性开始减低(~*P<0.05);4.Western Blot检测HUVECs细胞存在与ITLN-1相互作用的条带,对目标条带进行质谱分析得到322种蛋白,GO和KEGG分析得到六种蛋白,既是膜蛋白又参与有关的代谢通路。结论:1.成功构建敲减ITLN-1的CRISPR-Cas9体系,其中实验组2突变率最高;2.完成过表达ITLN-1质粒的构建,并推测ITLN-1其活性单位可能是多聚体形式;3.ITLN-1对HUVECs具有促进增殖作用;4.HUVECs可能存在与ITLN-1相互作用的分子,并初步筛选出“EPRS、GAPDH、PGAM1、LDHA、PAICS和DPM3”与ITLN-1具有相互作用。