【摘 要】
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目的:脓毒症是临床常见的危急重症之一,脓毒症急性肺损伤是脓毒症病人死亡的主要原因。肺泡巨噬细胞在脓毒症急性肺损伤中具有关键地位,细胞外组蛋白是新近研究发现的一种损伤相关分子模式分子,我们前期研究发现其在急性肺损伤中发挥重要作用,但是关于细胞外组蛋白在脓毒症肺损伤中介导炎症反应的具体机制尚未完全阐明。肺泡巨噬细胞中钾离子通道蛋白TWIK2在炎症反应中表达上调,可以活化NLRP3炎症小体,参与炎症反应
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目的:脓毒症是临床常见的危急重症之一,脓毒症急性肺损伤是脓毒症病人死亡的主要原因。肺泡巨噬细胞在脓毒症急性肺损伤中具有关键地位,细胞外组蛋白是新近研究发现的一种损伤相关分子模式分子,我们前期研究发现其在急性肺损伤中发挥重要作用,但是关于细胞外组蛋白在脓毒症肺损伤中介导炎症反应的具体机制尚未完全阐明。肺泡巨噬细胞中钾离子通道蛋白TWIK2在炎症反应中表达上调,可以活化NLRP3炎症小体,参与炎症反应。我们假设细胞外组蛋白通过上调肺泡巨噬细胞TWIK2表达来介导钾离子外流,从而活化NLRP3炎症小体,在脓毒症肺损伤中发挥介导炎症反应的作用。为了验证这一假设,本研究拟从细胞实验和动物实验2个层面来探索细胞外组蛋白-TWIK2活化肺泡巨噬细胞NLRP3炎症小体在脓毒症肺损伤中发挥的作用。方法:1.细胞实验:取小鼠原代肺泡巨噬细胞和肺泡巨噬细胞株加入LPS和/或不同浓度的外源性组蛋白刺激细胞。Western Blot检测不同刺激时间下肺泡巨噬细胞中TWIK2动态表达水平,ELISA检测细胞上清液中LDH及炎症因子水平,探索细胞外组蛋白诱导肺泡巨噬细胞TWIK2表达的最佳浓度和刺激时间;进一步检测LPS+外源性组蛋白对肺泡巨噬细胞内钾离子水平、NLRP3及ASC蛋白表达的影响,探索细胞外组蛋白诱导TWIK2表达对炎症小体活化的影响;再分别以细胞外组蛋白中和剂肝素、TWIK2抑制剂奎宁及炎症小体抑制剂MCC950进行干预,检测上述指标的变化水平。2.动物实验:构建小鼠脓毒症肺损伤模型来验证细胞外组蛋白通过上调肺泡巨噬细胞TWIK2表达,诱导NLRP3炎症小体活化,在脓毒症肺损伤中起到促进炎症反应的作用。构建小鼠CLP模型诱导小鼠脓毒症肺损伤,处死小鼠后取出肺组织进行H&E染色检测肺部病理性损伤变化;ELISA检测小鼠血浆和BLAF中细胞外组蛋白、LDH及炎症因子表达水平;Western Blot检测肺泡巨噬细胞TWIK2、NLRP3及ASC蛋白的表达;再用细胞外组蛋白中和剂肝素尾静脉注射进行干预,检测上述指标的变化;阐明细胞外组蛋白-TWIK2活化肺泡巨噬细胞NLRP3炎症小体在脓毒症肺损伤中的作用,探索脓毒症肺损伤治疗的新靶点。结果:1.体外实验:通过体外细胞实验发现细胞外组蛋白可诱导小鼠肺泡巨噬细胞TWIK2表达上调,促进钾离子外流活化NLRP3炎症小体,促进细胞炎症因子分泌。用LPS刺激细胞,加入不同浓度的外源性组蛋白后,显著提高肺泡巨噬细胞中TWIK2表达,降低细胞内钾离子水平,肺泡巨噬细胞中NLRP3及ASC蛋白表达均明显升高;细胞上清液中LDH及炎症因子IL-1β、IL-18、TNF-α水平明显上调;分别给予细胞外组蛋白中和剂肝素、TWIK2抑制剂奎宁及炎症小体抑制剂MCC950进行干预,可降低肺泡巨噬细胞的TWIK2表达,NLRP3及ASC蛋白表达均有下降,下调细胞炎症因子的分泌。2.体内实验:通过体内动物实验进一步验证细胞实验的结果,发现脓毒症肺损伤小鼠肺泡巨噬细胞中TWIK2、NLRP3及ASC蛋白表达明显升高,血浆和BLAF中细胞外组蛋白水平及LDH、IL-1β、IL-18、TNF-α水平明显升高。给予细胞外组蛋白中和剂肝素进行干预后,脓毒症小鼠肺损伤情况改善,提高小鼠生存率、减轻脓毒症肺损伤小鼠的肺部炎症反应。结论:细胞外组蛋白通过上调肺泡巨噬细胞TWIK2蛋白表达,促进钾离子外流,进一步活化NLRP3炎症小体,在脓毒症肺损伤中发挥促进炎症反应的作用,对细胞外组蛋白-TWIK2-NLRP3信号通路进行干预,可减轻脓毒症肺损伤小鼠的肺损伤,有望为临床脓毒症肺损伤治疗提供新的靶点。
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