【摘 要】
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该课题选用脐带血CD34+细胞为研究对象,在体外建立了CD34+细胞系特异性诱导分化成熟的培养体系,并优化向CD34+细胞转入外源基因的电穿孔条件,在此基础上,又通过电穿孔将含有
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该课题选用脐带血CD34+细胞为研究对象,在体外建立了CD34+细胞系特异性诱导分化成熟的培养体系,并优化向CD34+细胞转入外源基因的电穿孔条件,在此基础上,又通过电穿孔将含有人IX因子(hFIX)cDNA的人源基因载体p2B16导入脐带血CD34+细胞,了解在造血细胞发育过程中的FIX分泌情况,评估HSPC作为血友病B基因治疗靶细胞的可能性.本研究分为以下三个内容:1.脐带血CD34+细胞向各系列的体外诱导分化通过试验,建立了CD34+细胞向粒系、红系和血小板分化培养的技术平台,为分化过程中基因的调控,细胞因子的作用,外源基因的表达等相关研究建立了基础.2.质粒pEGFP-N1对CD34+细胞电转移条件的优化用电穿孔的方法,对脐带血CD34+细胞进行了pEGFP-N1的转染,以增强的绿色荧光蛋白(EGFP)为示踪蛋白,通过改变电压和电转液的组成,以优化CD34+细胞的电穿孔条件.同时,对骨髓来源的单个核细胞也进行了转染,并比较了两者在转染效率和EGFP表达上的异同.3.CD34+细胞诱导分化时hFIX人源基因载体的表达利用建立的电穿孔优化条件和系特异性培养体系,向脐带血CD34+细胞转染hFIX表达载体p2B16,转染后细胞在体外培养,并分别向粒系、红系和巨核系诱导分化,定期收集培养细胞的上清液,用一期法测定上清液中hFIX活性,ELISA法测定hFIX含量.
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