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鸡毒支原体(Mycoplasma gallisepticum,MG)属于柔膜体纲中的支原体目、支原体科、支原体属,是重要的禽病原体之一,主要引起鸡及其它禽类的慢性呼吸道疾病和火鸡传染性窦炎。鸡毒支原体感染和寄生最重要的步骤是借助表面的膜蛋白牢固地黏附在呼吸道黏膜固有层。可以说,黏附能力决定着支原体致病性的强弱。有鉴于此,本文选取了两种与致病力有关的膜相关酶——烯醇化酶(Enolase,Eno)和神经氨酸酶(Neuraminidase,NA)开展生物学功能研究,以揭示这些酶与MG致病机制之间的关系。1 MG烯醇化酶的生物学功能研究。根据Genbank中MG Rlow株的全基因序列,设计重叠PCR引物,扩增获得enolase基因,并成功获得960nt和1158nt两个位点的点突变。将突变后的enolase克隆入pET32a(+)载体中,进行原核表达,结果发现:MG Eno在大肠杆菌BL21(DE3)中呈高效可溶性表达。利用His Band Resin对表达产物进行纯化,纯化产物命名为rMGEno,产量为4.2mg/250mL。利用纯化的rMGEno免疫BALB/c小鼠,成功制备获得特异性多抗(AE09)和6株单抗,分别命名为:1A4、1E5、2E4、2F8、3B4和3D8。根据Western-blot、ELISA方法分别对上述抗体的效价进行了测定。为了验证烯醇化酶是否在支原体表面存在,本研究利用膜蛋白Western-blot检测、支原体悬浮荧光染色法和胶体金免疫电镜检测,结果证明:MG的外膜上存在烯醇化酶。烯醇化酶也可作为胞内酶参与糖酵解过程,催化2-磷酸甘油酸转变为磷酸烯醇式丙酮酸。为了验证原核表达产物的酶活性,本文通过NADH间接检测法成功测定出rMGEno相对比活力为25.22IU/mg;并确定在加入1μg rMGEno时,D-2-PG→PEP的酵解反应米氏常数Km为0.0696mol/L。为了研究烯醇化酶与MG黏附、入侵宿主细胞的关系,本文进行了rMGEno与血纤溶酶原(Plg)和纤连蛋白(Fln)的结合试验以及MG细胞黏附、细胞入侵阻断试验。结果显示:rMGEno为Plg与Fln结合蛋白,rMGEno抗体能够有效抑制MG黏附和入侵细胞(P<0.05),黏附阻断率与入侵阻断率分别为80.06%、83.01%。综上所述,我们可以证实:烯醇化酶是一种与固有层黏附有关的支原体膜相关酶,与鸡毒支原体的细胞黏附和细胞入侵有直接关系;在体外活性试验中,rMGEno具有烯醇化酶特性,具有良好的免疫原性。2 MG神经氨酸酶生物学功能的初步研究本研究通过神经氨酸酶检测试剂盒检测本室保存的MG各强弱毒株及其对应当传代株。结果发现:MG强毒株的NA活性较强,弱毒株的NA活性则较弱;而且,随着强毒株不断传代,毒力下降的同时,NA活性也明显下降。由此初步证明,NA与MG的毒力和生物被膜的形成有着极为密切的关系。为了进一步研究MG中NA的生物学功能,首先需要对NA基因进行多点突变。本研究根据将重叠PCR技术应用于支原体基因组的多点突变,成功地将MG NA中21个编码色氨酸的密码子UGA一次性点突变为UGG,使得NA可以顺利进行体外活性试验。这为MG NA在体内外的生物学功能研究奠定了基础。