背景动脉粥样硬化(Atherosclerosis，AS)易损斑块破裂是急性冠脉综合征(Acute coronary syndrome，ACS)的主要发病机制。斑块的易损性是决定斑块破裂的内在因素，易损斑块的特征主要包括薄的纤维帽、大的脂质核和大量炎症细胞的积聚。斑块的应力-应变状态改变是触发斑块破裂的外部因素。易损斑块的早期识别和干预对于急性心血管事件的预防具有十分重要的意义。研究动脉粥样硬化斑块不稳定的因素，促使易损斑块向稳定方向转变，是预防心脑血管事件的重要方法。易损斑块发生发展机制和预防、治疗等一系列研究均依赖于一个理想的动物模型，然而，目前的动物模型仍不够完善，主要存在以下几点问题：①斑块破裂的发生与人类病变的发展情况不够一致；②斑块内缺乏炎症反应；③斑块自发破裂率低，破裂处富含血小板和纤维蛋白的血栓少见。另一方面，由于仪器功能的限制，以往对小动物模型易损斑块的检测多集中于后期的组织学分析。晚近，高分辨率显微超声技术被用于追踪观察apoE基因敲除(apoE-／-)小鼠AS病变的发展。是否该技术亦可用于早期识别apoE-／-小鼠体内的易损斑块?目前国内外尚无相关报道。针对上述问题，本研究在apoE-／-小鼠高脂饮食的基础上，给予脂多糖和精神应激刺激，拟在通过多因素的联合干预构建斑块自发破裂率高的AS易损斑块动物模型，阐述多因素联合干预致斑块易损的机制。同时，应用显微超声技术检测模型在体的易损斑块，评价显微超声在apoE-／-小鼠易损斑块识别中的应用价值。目的1．通过多重因素联合干预构建高度模拟人类AS病变的易损斑块动物模型。2．阐述多重因素联合干预促进斑块破裂的病理生理学机制和分子生物学机制。3．评价显微超声在apoE-／-小鼠易损斑块识别中的应用价值。方法1．动物实验：108只10-12周龄的雄性apoE-／-小鼠实验全程高脂饮食(含0.25％胆固醇和15％脂肪)喂养。实验动物随机分为4组：应激组，脂多糖组，脂多糖／应激组和对照组，每组27只。全部实验鼠均于实验初行左颈总动脉套管(缩窄性硅胶管)术以诱发AS病变。脂多糖组于颈动脉套管手术4周后给予脂多糖腹腔注射(1mg／kg，每周2次，持续8周)；应激组于颈动脉套管手术8周后给予精神应激刺激(足底电击和噪音刺激，每天1小时，持续4周)；应激／脂多糖组联合给予应激和脂多糖刺激；对照组不给任何刺激。2．血流动力学评价：实验末期通过鼠尾测压仪测量实验鼠的收缩压、舒张压和心率；通过显微超声仪测量颈动脉斑块部位最大血流速度(Vmax)和左室射血分数(LVEF)，评价机体全身和局部的血流动力学状态。3．易损斑块的超声影像学形态特征：应用显微超声技术测量斑块长度、外弹力膜面积(EEMA)、斑块面积、内膜-中层厚度(IMT)和斑块近端的Vmax。计算斑块的偏心指数(EI)和重构指数(RI)。4．血清去甲肾上腺素(NE)和生化指标检测：末次应激实验结束后，即刻予全部动物眼球后采血。测定血清中NE、高敏C-反应蛋白(hsCRP)、血脂和血浆纤维蛋白原浓度。5．病理学检测：颈动脉斑块组织学切片分别行苏木素-伊红染色、Masson三染、天朗猩红染色、Verhoeff染色、油红O染色、Perl’s染色(含铁血黄素染色)，并进行免疫组织化学染色观察巨噬细胞(MOMA-2)、平滑肌肌动蛋白(α-SM-actin)的局部表达。测量斑块面积、血管面积和纤维帽厚度；测量胶原、脂质、平滑肌细胞、巨噬细胞免疫组化阳性染色面积，并计算它们占斑块面积的比例。统计斑块的破裂率，计算易损指数。易损指数=(巨噬细胞+脂质)面积阳性百分比／(平滑肌细胞+胶原)面积阳性百分比。6．实时定量RT-PCR：实时荧光定量RT-PCR反应检测斑块内IL-6、IL-18、TNF-α、MCP-1、MMP9、MMP12 mRNA的表达水平。结果1．动物的基本特征：应激朋旨多糖组有1只动物于首次注射脂多糖后死亡，其余动物全部完成实验。动物各组间体重无明显差异。2．血流动力学评价：应激显著增加收缩压、舒张压、心率、Vmax和LVEF(均P＜0.001，Factorial ANOVA)。应激和应激／脂多糖组收缩压、舒张压、心率、Vmax和LVEF显著高于脂多糖组(均P＜0.001)和对照组(均P＜0.001)。3．AS易损斑块影像学特征：显微超声测量的斑块面积(r=0.606，P=0.004)、IMT(r=0.777，P＜0.001)、偏心指数(r=0.784，P＜0.001)和重构指数(r=0.854，P＜0.001)与组织学检测结果有显著的相关性。破裂斑块的平均IMT(0.34±0.09比0.22±0.07 mm，P＜0.001)和EI(0.72±0.15比0.48±0.18，P＜0.001)均显著高于非破裂组。71.4％的破裂斑块呈现明显的血管正性重构，破裂组的平均重构指数显著高于非破裂组(1.19±0.15比1.03±0.07，P=0.002)。破裂斑块组近端的Vmax显著高于非破裂斑块组(1.22±0.34比0.79±0.25 m／s，P＜0.001)。Logistic回归分析结果显示斑块IMT和斑块近端的Vmax是预测斑块破裂的独立因素，其OR值分别为1.017(95％CI：1.004-1.030)和1.005(95％CI：1.001-1.009)。4．血液NE和生化检测：应激显著升高血清NE水平(P＜0.001，FactorialANOVA)。应激组和应激／脂多糖组的NE浓度明显高于脂多糖组(均P＜0.001)和对照组(均P＜0.001)。应激和脂多糖均明显导致血清hsCRP浓度升高(均P＜0.001，Factorial ANOVA)，并且应激与脂多糖联合作用具有协同作用(P=0.003，Factorial ANOVA)，联合处理组的hsCRP水平显著高于应激组(P＜0.001)和脂多糖组(P＜0.001)。各组间总胆固醇、甘油三酯、高密度胆固醇和低密度胆固醇浓度均没有统计学差异。应激和脂多糖均显著增加血浆纤维蛋白原浓度(均P＜0.001，Factorial ANOVA)，应激／脂多糖组的纤维蛋白原浓度显著高于应激组(P＜0.001)和脂多糖组(P＜0.001)。5．应激和脂多糖联合刺激产生的AS易损斑块表型：应激和应激／脂多糖组斑块破裂率均显著高于对照组(P=0.036，0.036)。应激／脂多糖组中2例发生斑块破裂伴腔内血栓，1例发生斑块内出血。应激组有1例斑块肩部断裂伴出血。各组间斑块面积没有统计学差异。应激和脂多糖刺激均显著降低斑块纤维帽厚度(均P＜0.001，Factorial ANOVA)，降低帽／核比值(均P＜0.001，Factorial ANOVA)，并且联合应用具有协同效应(P=0.048，0.019，Factorial ANOVA)。应激／脂多糖组的胶原含量显著减少(均P＜0.01)，脂质含量显著增加(均P＜0.01)，巨噬细胞明显增多(均P＜0.05)。应激和脂多糖联合应用对巨噬细胞和胶原含量有显著的协同效应(P=0.013，0.043，Factorial ANOVA)。各组间斑块内平滑肌细胞含量没有统计学差异。应激／脂多糖组斑块的易损指数为2.53±0.54，显著高于其它各组(对照组：0.85±0.07，P＜0.001；脂多糖组：1.81±0.14，P=0.001；应激组：1.78±0.12，P=0.001)。6．斑块内基因的表达：应激显著增加斑块内IL-6(P=0.001)、IL-18(P=0.01)、TNF-α(P=0.044)、ICAM-1(P=0.018)、MCP-1(P＜0.001)、TF(P=0.014)、MMP9(P=0.007)和MMP12(P=0.039)的表达；脂多糖显著增加斑块内IL-6(P=0.030)、ICAM-1(P=0.022)、TF(P=0.049)和MCP-1(P=0.017)的表达。应激／脂多糖组斑块内各炎性因子和MMPs的表达量均显著高于对照组(均P＜0.05)，其中MCP-1和MMP9的表达明显高于脂多糖组(P=0.004，0.023)。结论1．在高脂喂养的apoE-／-小鼠的颈动脉，先通过套置缩窄性套管的方法诱发AS斑块形成，再通过精神应激联合脂多糖刺激的方法促进斑块发生易损性改变，并自发破裂。这种多因素联合干预导致的斑块破裂模型，其自发破裂率高，并伴发血栓形成和斑块内出血，与人类病变极为相似。2．机体的高血流动力学反应、高凝状态和炎症反应增强是促进斑块自发破裂，并伴发血栓形成的主要机制。应激激活交感神经系统，血液NE浓度升高，血流动力学反应增强，使斑块的应力-应变状态发生改变。在应激和脂多糖联合作用下血液纤维蛋白原升高，血液高凝；血液中的hsCRP浓度增高，斑块内炎性细胞因子和基质金属蛋白酶表达增多，炎症反应活跃，导致斑块不稳定，自发破裂并血栓形成的几率增加。3．显微超声技术适用于检测apoE-／-小鼠颈动脉的AS易损斑块，其测量结果与组织学测量结果有良好的相关性；反映斑块内在属性的内膜-中层厚度(IMT)和影响斑块外部受力状态的Vmax是预测斑块破裂的独立因素。背景动脉粥样硬化(Atherosclerosis，AS)是由炎细胞浸润、平滑肌细胞增殖、细胞外基质增加及血栓形成等多种病理过程参与的慢性炎症性疾病，早期AS病灶内即可见到单核／巨噬细胞的聚集。斑块内的炎细胞合成分泌炎性细胞因子和基质金属蛋白酶，增强斑块的炎症反应，增加斑块的易损性。在众多炎性因子中，单核细胞趋化蛋白-1(monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1)是调节单核／巨噬细胞聚集与活化的重要的化学因子，它的主要作用是趋化血液中的单核细胞至病变血管内皮下，这是导致AS炎症反应、促进斑块不稳定的关键环节。研究显示，抑制体内MCP-1的表达可明显减轻AS病变程度，延缓疾病的进展。基因沉默技术，又称RNA干扰(RNA interference，RNAi)，可以高效特异地阻断目标基因的表达，目前已经广泛地应用于体内和体外基因功能的研究中。哺乳动物细胞实验发现，化学合成的21-23核苷酸长的小分子干扰RNA片段(small interfering RNAs，siRNAs)，或是质粒或病毒载体介导的发夹结构RNA(small hairpin RNA，shRNA)，均可引发基因沉默或者表达抑制。RNA干扰技术在细胞水平致病基因的功能研究中得到广泛应用。此外，通过高通量RNAi筛选，siRNA和shRNA还被用于系统分析某些疾病(如肿瘤)的多种致病基因。借助于质粒或病毒载体的介导，shRNA已经被用于体内实验，特异性降低靶基因的表达。在进一步完善siRNA稳定性的基础上，RNAi的试剂有望应用于临床。目前，将RNAi技术应用于AS易损斑块体内治疗的实验研究在国内外尚为少见。为此，本课题拟在通过体内转染病毒载体介导的MCP1-shRNA特异性地抑制AS易损斑块内MCP-1基因的表达，进而观察MCP-1基因沉默对斑块稳定性的影响，并进一步阐述其作用机制。目的1．通过RNAi技术设计合成针对小鼠MCP-1基因的shRNA，构建重组腺病毒载体pGSadeno-MCP1-shRNA。2．ApoE-／-小鼠颈动脉易损斑块局部转染pGSadeno-MCP1-shRNA，观察斑块性状的变化。3．揭示MCP-1基因沉默对易损斑块稳定性的影响及其作用机制。方法1．pGSadeno-MCP1-shRNA病毒载体的构建：利用RNA干扰技术，设计合成针对小鼠MCP-1基因的shRNA，构建腺病毒介导的携带绿色荧光蛋白(GFP)的pGSadeno-shRNA病毒载体，同时构建pGSadeno-HK作为阴性对照。2．动物模型：通过应激、脂多糖联合刺激的方法构建AS易损斑块动物模型。80只10-12周龄雄性apoE-／-小鼠，均给予高脂饮食(含0.25％胆固醇和15％脂肪)。予实验动物施行左颈总动脉套管术以诱发AS病变。手术4周后给予脂多糖腹腔注射(1mg／kg，每周2次，持续8周)，手术8周后给予精神应激刺激(足底电击和噪音刺激，每天1小时，持续4周)。具体实验步骤见论文第Ⅰ部分脂多糖／应激组动物模型的构建。3．pGSadeno-shRNA体内转染实验：颈动脉套管手术10周后，RNAi组(n=40)局部转染pGSadeno-shRNA，对照组(n=40)局部转染阴性对照pGSadeno-HK。病毒转染3天后RNAi组随机处死1只动物，检测斑块内和心脏、肝脏、肾脏内GFP的表达。余实验鼠于病毒转染14天后处死，观察斑块内GFP的表达，检测斑块的病理学形态结构和斑块内MCP-1的表达。4．血液生化指标检测：检测血清总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)的水平。5．病理学检测：对颈动脉斑块分别进行H&E染色、Masson三染、油红O染色、天狼猩红染色、Verhoeff染色，Perl’s染色，并通过免疫组织化学方法检测斑块内巨噬细胞(MOMA-2)、平滑肌肌动蛋白(α-actin)、单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)、以及金属蛋白酶2、9、12(MMP-2、MMP-9、MMP-12)的表达。测量斑块面积和纤维帽的厚度，观察斑块的形态结构，计算斑块的破裂率。检测斑块内胶原、脂质、巨噬细胞、血管平滑肌细胞的含量，计算易损指数：易损指数=(巨噬细胞+脂质)阳性面积百分比／(平滑肌细胞+胶原)阳性面积百分比。检测斑块内MCP-1及MMPs的含量。6．实时定量RT-PCR检测：取新鲜颈动脉斑块组织，提取RNA，实时荧光定量RT-PCR反应检测MCP-1 mRNA的表达水平。。7．Western blot检测：取新鲜颈动脉斑块组织，提取蛋白质，Western blot检测斑块内MCP-1蛋白的表达。结果1．pGSadeno-shRNA病毒载体的构建：制备载体编码的携带GFP和小鼠MCP-1基因的pGenesil-1-shRNA-MCP1融合蛋白共表达质粒载体，转染HK293细胞，48小时后荧光显微镜下观察。结果表明，MCP1的表达减少83.3％。通过基因重组技术构建pGSadeno-shRNA腺病毒载体，PCR反应鉴定，证实反应产物正确。2．pGSadeno-shRNA体内转染：pGSadeno-shRNA转染3天后颈动脉AS斑块内GFP的表达量为39.26％；转染14天后斑块内GFP的表达量减少至20.28％。3．血液生化指标检测：RNAi组和对照组血清TC、TG、HDL-C、LDL-C未见统计学差异。4．病理学检测：RNAi组和对照组各取15只动物分析斑块的病理学特征。结果显示，两组间斑块面积无显著性差异(88000±13000比102000±21000μm~2，P=0.086)；与对照组比较，RNAi组纤维帽厚度明显增加(8.48±2.62比6.44±1.07μm，P=0.035)，帽／核比值明显增加(0.09+0.03比0.06±0.02，P=0.042)；胶原含量明显增加(18.67％±4.43％比10.11％±4.08％，P=0.003)，脂质含量明显减少(13.16％±1.66％比19.04％±3.07％，P=0.0015)。RNAi组有1例斑块内埋藏的纤维帽，1例纤维帽中断，未见血栓和出血现象，斑块破裂率为13.33％；对照组有2例斑块破裂并血栓形成，2例斑块内出血，3例斑块内埋藏的纤维帽，2例纤维帽中断，破裂率达60％。统计分析显示，RNAi组斑块破裂率显著降低(P=0.01)。RNAi组α-SMC-actin表达明显增多(10.30％±2.92％比6.75％±1.16％，P=0.011)，巨噬细胞明显减少(8.19％±3.68％比14.05％±2.61％，P=0.006)。RNAi组斑块内MCP-1的表达比对照组减少69.7％，两组比较有显著的统计学意义(4.44％±0.73％比14.65％±3.46％，P＜0.001)。RNAi组斑块内MMP-2、MMP-9、MMP-12的表达也显著低于对照组(均P＜0.05)。与对照组比较，RNAi组易损指数明显降低(0.78±0.32比2.19±0.94，P=0.006)。5．实时定量RT-PCR检测与对照组相比，RNAi组颈动脉斑块组织中MCP-1 mRNA的表达量减少76.5％，两组间统计学差异显著(P=0.03)。6．免疫印迹(Western blot)检测：与对照组相比，RNAi组颈动脉斑块组织中MCP-1蛋白的表达量减少66.7％，两组间存在显著的统计学差异(0.24±0.01比0.72±0.03，P＜0.001)。结论1．本研究成功地利用RNA干扰技术设计合成针对小鼠MCP-1基因的重组腺病毒表达载体pGSadeno-shRNA。2．体内实验结果表明，基因沉默技术能有效的抑制斑块局部MCP-1基因的表达，显著减少斑块内巨噬细胞的含量，降低斑块内MMPs的表达，从而抑制斑块内炎症反应，增强斑块的稳定性。