近年来,随着药物研发技术的快速发展,为人类健康提供了更有利的保障。在药物研发过程中,药物分析发挥着至关重要的作用,它不仅关系到药品的质量控制和质量保证,而且也指导用药安全。由于高效液相色谱法（HPLC）具有高分辨率、高灵敏度、高选择性、与质谱兼容性好等特点,被广泛应用于药物的分离分析和含量测定等研究中。根据中国药典的记载,从1985年到2015年,高效液相色谱法的使用频率由8次增加到3556次,成为药物分析中一种重要的分析方法。高效液相色谱法包括反相液相色谱法（RPLC）、正相液相色谱法（NPLC）、亲水相互作用色谱（HILIC）、离子交换色谱（IEC）以及多模态液相色谱（MMC）。其中,RPLC具有分离效率高、重现性好以及与质谱兼容的特点,是应用最广泛的分离技术,但其只适用于分离非极性或弱极性物质。NPLC能够分离极性物质,但其通常使用非极性或弱极性有机溶剂作为流动相,不适用于在有机溶剂中溶解性差的极性物质,而且流动相中微量的水相就会致使平衡困难或不可逆吸附。HILIC也是一种正相色谱,其流动相可有水相的参与,适用于分离极性物质和亲水性物质,但其对非极性物质的保留很弱。IEC可用于分离离子化合物,但其不能很好的分离中性化合物。为了扩大色谱分离范围,色谱工作者在单一色谱分离模式的基础上,发展了多模态液相色谱（MMC）,它是在一种色谱填料组成的色谱柱上,通过改变流动相组成,以展现出多种色谱保留行为从而实现对复杂化合物分离的液相色谱。在高效液相色谱系统的组成中,色谱柱是其核心部件,也是制约色谱分离技术分析效能的关键因素,通常由色谱填料装填在不锈钢柱管中组成。因此,制备具有优良的物理化学稳定性、规整且均一的球形以及合适的孔结构参数的色谱填料具有重要意义。二氧化硅作为一种无机基质,不仅具有较好的物理化学稳定性、较高的机械强度和可控的形貌结构,而且其表面还具有丰富的硅醇基活性基团。通过硅醇基,二氧化硅的表面可与特定功能基团的硅烷化试剂相结合制备固定相介质。因此对二氧化硅进行功能化修饰成为制备新型色谱固定相的重要手段。目前对二氧化硅进行功能化修饰的主要方法包括有机溶剂法、超临界流体法和气相沉积法等。其中,有机溶剂法通常是将二氧化硅微球、硅烷化试剂和三乙胺等碱性催化剂在无水甲苯、二甲苯等溶剂中回流反应一定时间,反应后的产品分别用甲苯、乙醇等溶剂洗涤、干燥即可。虽然有机溶剂法是较为经典和常用的方法之一,但其通常利用甲苯、二甲苯等试剂作为反应溶剂,并且需要在无水无氧的条件下进行反应,不仅对人体和环境有害,而且难以控制的反应条件导致键合效率较低、重复性差。超临界流体法,简而言之就是将二氧化碳等超临界流体代替无水甲苯、二甲苯等有机溶剂作为反应介质,利用这种方法得到的材料克服了有机溶剂法键合效率低的问题,具有较高的表面覆盖率,但其对反应设备要求苛刻,且操作不便。气相沉积法,是一种不使用任何有机溶剂的方法,即硅烷化试剂在一定温度条件下气化挥发后直接与硅醇基进行反应。该方法不以甲苯等有机溶剂或二氧化碳等超临界流体作为反应介质,简单方便,绿色环保,且可获得较高的键合相密度。目前,气相沉积法已成功应用于氨丙基、环氧丙基以及巯丙基等硅胶材料的制备中,同时也可用气相沉积法进行封尾处理。但是目前应用气相沉积法键合的硅烷化试剂沸点均较低,在一定温度下易挥发。对于高沸点、难挥发的硅烷化试剂,如十八烷基等硅烷化试剂,气相沉积法的使用仍有一定局限性。在高效液相色谱法中,RPLC是应用最广泛的分离技术。C₁₈色谱固定相作为最常用的反相色谱固定相,目前商品化产品通常使用有机溶剂甲苯法制备得到。甲苯溶液在常温常压下沸点为105℃,而十八烷基硅烷化试剂沸点较高,如十八烷基三氯硅烷在常温常压下沸点高达380℃。较高的沸点使得C₁₈色谱固定相键合效率低、重复性差且对设备要求严格。近年来,在生物传感器和DNA微阵列等相关领域,有学者利用浸渍法在硅胶或玻璃表面制备硅烷化薄膜,用于连接DNA等物质。该方法不仅在室温条件下就可使硅烷化试剂吸附在二氧化硅微球表面,而且可获得整齐的表面结构。但是这种方法在制备硅烷化薄膜时,只是使硅烷化试剂整齐排列在硅胶或玻璃表面。因此,我们以期通过改良浸渍法来制备C₁₈反相色谱固定相。在各种新型药品的研制过程中,越来越多的复杂化合物不断出现,使用反相色谱等单模态色谱难以对这些化合物进行较好的分离。MMC是一种可以展现出多种色谱保留机理从而实现对复杂化合物分离的色谱模式。RPLC通常用于分离非极性化合物,而HILIC可分离高极性和亲水性化合物,因此反相/亲水多模态色谱（RPLC/HILIC）无疑是一种良好的结合。目前常见的反相/亲水多模态色谱填料主要有二醇基、氨基和氰基等基团功能化的色谱填料。其中,氰基色谱柱是一种较为常用的正相色谱柱。20世纪70年代,氰基色谱柱作为一种正相色谱柱应用于高效液相色谱法,由于氰基具有一定的极性且具有偶极-偶极相互作用,可以与极性物质或物质的极性部位进行反应,使得氰基色谱柱具有特殊的选择性,且平衡时间较短。21世纪初,氰基柱得以商品化,但其使用仍不广泛。一是由于其键合相侧链较短等原因,使其稳定性较差,二是目前商品化的氰基色谱柱的制备方法仍然使用了有机溶剂法。“巯基-烯”点击化学反应在化学合成领域备受关注,一方面由于其具有高反应效率、高选择性、温和的反应条件、环境友好等点击化学反应共有的特点,另一方面它还具有生物相容性良好这一独特优势。因此,“巯基-烯”点击化学反应已成功应用于药物载体的合成、表面修饰及高分子合成等领域。近年来,“巯基-烯”点击化学在色谱领域发展迅速,被广泛应用于色谱填料的合成与修饰。在2004年,有学者就通过“巯基-烯”点击化学反应制备得到不同烷基链长修饰的反相色谱填料。2009年,我们实验室利用气相沉积法制备得到巯基硅胶作为贵金属钯（Ⅱ）的高效吸附剂,并证明巯基硅烷试剂的功能基团均以双齿键合结构为主,且与有机溶剂法相比具有较高的键合密度。但是该方法制备的巯基硅胶并不能用于高效液相色谱填料,一方面是因为所用的硅胶基质为无定型硅胶,另一方面巯基侧链较短影响填料的使用寿命。因此,为了提高氰基色谱填料的稳定性,本文提出一种气相沉积法和“巯基-烯”点击化学反应相结合的方法制备反相/亲水多模态氰基色谱填料,以期通过“巯基-烯”点击化学反应延长侧链,从而提高氰基色谱柱的稳定性。随着研究的不断深入,我们发现利用气相沉积法与“巯基-烯”点击化学反应制备的氰基多模态色谱固定相,与传统的氰基色谱柱相比,对多环芳烃表现出更高的选择性。此外,在研究中发现,氰基多模态色谱固定相在高有机相条件下分离核苷和碱基等碱性物质时,与在高水相条件下出峰次序一致,这可能与流动相、被分析物质以及固定相的性质相关。因此对氰基多模态色谱固定相的保留机理进行了探讨。综上所述,为了解决高沸点、难挥发的硅烷化试剂制备键合硅胶色谱固定相的问题,本文针对常用的C₁₈反相色谱固定相和分离范围更大的反相/亲水多模态氰基色谱填料,提出了环境友好型的、无溶剂的高效液相色谱固定相的制备方法,其不仅具有绿色环保的性能优势,也提高了色谱填料的键合相密度。因此,针对上述问题,本文开展了三个研究内容。研究内容一,通过应用浸渍法与气相沉积法相结合的方法制备C₁₈反相色谱固定相,优化制备条件并深入了解分离鉴定技术对反相色谱固定相的要求。研究内容二,提出气相沉积法和“巯基-烯”点击化学反应相结合的方法制备反相/亲水多模态氰基色谱填料,系统研究制备的氰基色谱填料在反相、亲水条件下的色谱分离性能以及水热稳定性。研究内容三,对所制备的氰基色谱填料的保留机理进行研究,进一步揭示其在分离分析中的作用机理。研究内容详细介绍如下:首先,通过浸渍法与气相沉积法制备了C₁₈反相色谱固定相,制备过程为:硅胶、十八烷基硅烷加入浸渍溶剂中,在30℃,300 rmp的条件下浸渍吸附4 h,旋蒸除去浸渍溶剂,150℃、氮气保护条件下反应6 h,制备得到C₁₈键合硅胶。以六甲基二硅氮烷（HMDS）为封尾试剂,通过气相沉积法对C₁₈键合硅胶进行封尾处理,制备得到C₁₈反相色谱填料。考察了浸渍溶剂、浸渍时间、硅烷化试剂用量以及硅烷化试剂种类等因素对制备过程的影响。通过条件考察,选择乙醇为浸渍溶剂,十八烷基二甲基氯硅烷（ODC）为键合试剂,制备得到C₁₈键合硅胶色谱填料,并对其进行了红外、元素分析以及孔结构参数的表征。装柱后,以SRM 870混合物为测试体系,测定C₁₈反相色谱填料的亚甲基选择性、残余金属离子活性以及表面残余硅醇基活性。测试结果表明SRM 870混合物在浸渍法与气相沉积法相结合的方法制备的C₁₈反相色谱柱上均取得了良好的分离效果;同时与无水甲苯法和Kromasil C₁₈商品柱的相比较,浸渍法与气相沉积法相结合的方法制备的C₁₈反相色谱固定相具有较高的键合效率、较低的金属离子活性以及较低的硅醇基活性。对制备得到的C₁₈反相色谱填料进行了重复性考察,实验结果表明浸渍法与气相沉积法相结合的方法制备的C₁₈反相色谱固定相具有良好的重复性。其次,以3-巯丙基三甲氧基硅烷（3-MPTMS）为键合试剂,利用气相沉积法将其键合在硅胶表面制备得到巯基硅胶,然后巯基硅胶通过“巯基-烯”点击化学与烯丙基氰进行反应制备得到了具有较高稳定性的反相/亲水多模态的氰基色谱填料。本文采用¹³C固体核磁和元素分析进行了定性和定量的表征;以烷基苯的同系物为评价体系,评价了其反相色谱行为;以核苷和碱基分子为探针,评价了其亲水相互作用的色谱行为;同时通过调节流动相中水相的比例,评价了其反相/亲水双模态的色谱保留行为;以戊苯为探针分子,在高温、高pH的条件下对其进行了加速稳定性实验的评价。以上的评价结果表明气相沉积法和“巯基-烯”点击化学反应相结合制备得到的氰基色谱填料由于具有巯基和烯丙基组成的疏水侧链以及极性基团氰基,从而具有疏水相互作用和亲水相互作用;通过核苷和碱基分子的保留因子随水相比例的变化的结果呈现“U”型曲线,揭示了其反相/亲水多模态的色谱保留行为。而且,与传统的氰基色谱填料对比,在相同的键合相密度的条件下,其具有更高的水热稳定性。最后,对制备的氰基色谱固定相的保留机理进行了研究,探讨了硫醚结构、氰基和残余硅醇基对色谱保留行为的影响。首先,利用气相沉积法和“巯基-烯”点击化学制备得到1-丁烯（Sil-S-C₄）、烯丙基氰（Sil-S-CN）与辛基（Sil-C₈）色谱固定相,并进行封尾处理。然后,采用Tanaka色谱评价体系评价了三种色谱固定相在反相条件下的亚甲基选择性、立体选择性以及残余硅羟基活性。同时,根据线性溶剂参数理论,比较了三款柱子与测试物质之间的相互作用,探究了硫醚结构、氰基对含芳烃基团的物质的色谱保留行为的影响。最后,以盐酸可乐定、硫酸普萘洛尔和盐酸阿米替林三种碱性药物作为模型化合物,深入探讨了氰基色谱填料对碱性物质的保留机理,并且考察了pH,离子强度和溶剂强度对碱性物质保留的影响。结果表明,在相同碳含量条件下,Sil-C₈色谱固定相具有较高的疏水选择性,而Sil-S-CN色谱柱具有较高的立体选择性;线性溶剂参数理论表明氰基与芳烃物质之间的偶极-偶极相互作用,以及硫醚结构通过硫原子上孤对电子与芳烃物质之间发生的给电子-吸电子作用对芳香化合物保留选择性的具有较大的影响;并且证实了碱性物质在氰基色谱填料上的保留因子k主要由三部分构成,即反相作用下的纯疏水保留k_rp,硅醇基与碱性药物发生的离子交换作用贡献的保留k_ex,以及疏水作用和离子交换耦合作用条件下的保留k^*_rpk^*_ex。其中,pH对碱性物质保留的影响与物质本身的pKa相关,随着流动相pH的增大,三种碱性药物的保留因子均呈现先逐渐增大后下降的趋势。整体保留k值随离子强度的增强而降低,说明离子交换作用k_ex的存在。整体保留k值随溶剂强度的增强而降低,说明疏水相互作用k_rp的存在;又因为离子交换作用不随溶剂强度的改变而改变,且整体保留k值与溶剂强度的之间的关系呈现向下凹的曲线,由此说明疏水作用和离子交换耦合作用条件下的保留k^*_rpk^*_ex。由此可见,硅醇基与碱性药物发生的离子交换作用对碱性物质的整个保留的贡献发挥着至关重要的作用。虽然在浸渍法和“巯基-烯”点击化学反应中会使用绿色溶剂乙醇、甲醇,但这些溶剂在反应过程中需被去除,而且气相沉积法不需要使用任何有机试剂,因此本文将这两种制备路径统称为无溶剂法。上述研究内容表明,应用浸渍法与气相沉积法相结合的方法和气相沉积法与“巯基-烯”点击化学反应相结合的方法制备色谱固定相,不仅避免了使用大量的高毒性有机溶剂,节能降耗、绿色环保,而且具有较高的键合相密度。无溶剂法推动了色谱填料制备方法的发展,将节能环保理念融入到色谱分析的研究中。