论文部分内容阅读
绛红小单孢菌是庆大霉素产生菌。本研究以绛红小单孢菌为研究对象,阻断庆大霉素生物合成基因簇上的genK、ge讲D1、genX和genP四个关键基因,构建GbK987、GD1989、GX322、GP408和KP310等绛红小单孢工程菌。具体内容包括以下几个方面:第一,高产庆大霉素C1a工程菌的构建。选育绛红小单孢菌Gb987为出发菌,通过结合转移将重组质粒pFD308导入Gb987,经筛选得到绛红小单孢工程菌GbK110(Gb987△gennK;结合TLC、MS和HPLC分析结果显示,GbK110次级代谢产物主要积累庆大霉素C1a,C1a含量由原来的62.83%提高到85.24%。经遗传稳定性考察和发酵条件优化,摇瓶发酵生物效价从592/mL提高到668 μ/mL。第二,庆大霉素A工程菌的构建。以温敏型穿梭质粒pKC1139为载体,构建敲除基因genD1重组质粒pGD14。通过接合转移,将重组质粒pGD14导入绛红小单孢菌GK1101(G1008△genK)中,经过筛选和鉴定得到工程菌GD1989(GK1101△gennD1)。经TLC和MS分析其次级代谢产物,结果显示GD1989不再合成庆大霉素C族产物,只积累中间物质庆大霉素A。表明genD1基因参与庆大霉素A C-4"甲基化作用,敲除genD1阻断庆大霉素A到庆大霉素X2的合成,获得主产庆大霉素A的小单孢工程菌GD1989。已申请国家发明专利,在中国药科大学学报上发表论文。第三,工程菌GX322的构建。采用与庆大霉素A工程菌相似的研究方法,构建genX基因缺失工程菌GX322(G1008△genX)。对工程菌代谢产物进行检测,结果表明GX322次级代谢产物中C1、C2及C2a组分比例发生变化,推测genX基因可能与庆大霉素的生物合成密切相关,参与庆大霉素C1这一支路合成代谢过程。第四,工程菌KP310的构建。采用与庆大霉素A工程菌相似的研究方法,以GbK110为出发菌构建genP基因缺失工程菌KP310(GbK110△genP),对工程菌代谢产物进行检测,结果表明;敲除gen供后KP310次级代谢产物没有庆大霉素C族组分,主要积累JI-20A。证明genP基因参与绛红糖胺3’,4’脱羟基过程。第五,工程菌GP408的构建。采用与庆大霉素A工程菌相似的研究方法,以G1008为出发菌构建genP基因缺失工程菌GP408(G1008AgenP)。工程菌GP408次级代谢产物没有庆大霉素C族组分,与KP310积累不同的代谢产物不同,GP408主要积累JI-20B。