论文部分内容阅读
随着灵芝完整遗传信息的公布,灵芝有极大的概率作为高等食药用真菌的研究模板,而灵芝的活性成分,尤其是灵芝多糖,一直是人们关注的焦点。目前,对灵芝菌胞外多糖的研究主要集中在两方面,一是通过优化发酵条件及应用不同的工程策略等手段,提高液体发酵生产灵芝多糖的产量;二是提取、分离、纯化灵芝菌胞外多糖,对其进行结构鉴定和活性研究。然而,有关灵芝菌产胞外多糖的合成机理和提高灵芝多糖活性的研究鲜有报道。本文研究了氮源对灵芝胞外多糖合成的影响,对发酵所得多糖进行了结构分析,进而为了提高灵芝胞外多糖活性,制得并表征了纳米化的灵芝胞外多糖,研究了灵芝纳米多糖在面团发酵体系中对馒头发酵过程的调控作用,为“大健康”背景下主食工业升级的需求提出了可行的思路和途径。主要研究结果如下:（1）利用氮限制调控策略提高了灵芝多糖的产量。在5 mM的天冬氨酸浓度作为氮源限制条件时,获得了0.4 g/L的多糖产量,比氮源为20 mM的天冬氨酸时的情况,产量提高了23.21%。同时qRT-PCR进一步证明在氮限制的情况下灵芝多糖生物合成途径中Glucokinase、α-Phosphoglucomutase、UDP-glucose pyrophosphorylase以及1,3-β-glucan等关键基因比氮充足情况下分别上调了30.00%,35.00%,16.67%和17.85%。（2）分析比较氮限制条件下产生的灵芝胞外多糖结构和生物活性是否发生改变。利用灵芝液体深层发酵得到的灵芝胞外粗多糖,经醇沉富集、离子交换柱以及凝胶色谱柱分离纯化后可以得到一种灵芝胞外多糖GLP-1-1,其分子量为22014 Da,主要单糖为葡萄糖（92.33%）、甘露糖（7.55%）和半乳糖（0.22%）。同时利用红外光谱法对GLP-1-1的化学基团进行了检测,并利用甲基化方法对灵芝多糖中单糖的链接方式进行了分析,发现甘露糖仅在多糖GLP-1-1的末端,而葡萄糖是GLP-1-1的主链和侧链主要组成部分。考察了灵芝多糖GLP-1-1的抗氧化活性和对肿瘤细胞活性的影响。相比离子交换柱中得到的GLP-2灵芝多糖,GLP-1-1在抗氧化活性中的自由基清除率和还原能力中具有更高的活性,同时对肿瘤细胞活性的影响也表明GLP-1-1相比GLP-2具有更高抑制肿瘤细胞生长的活性。通过分析灵芝多糖GLP-1-1对两种肿瘤细胞A431和MDA-MB-231的细胞周期影响发现,相比未添加灵芝多糖的对照组,A431和MDA-MB-231的G1/G0期细胞比例分别增加了73.77%和28.60%。表明灵芝多糖GLP-1-1可能是通过调控细胞周期的方式,抑制肿瘤细胞的生物活性。（3）利用纳米制备的方法提高灵芝多糖的粒径分布和免疫活性。通过球磨法制备了灵芝多糖纳米微粒（GLPN）,扫描电子显微镜（SEM）和激光粒度仪检测结果表明,纳米粒基本成球形,80%水合粒径集中在465 nm。GLPN对体外培养的L929成纤维细胞生长无抑制作用,且为安全无毒性;最高浓度10 mg/mL的GLPN纳米粒的溶血率低于5%;小鼠给予2000 mg/kg剂量的GLPN均未见死亡,表明GLPN安全无毒。（4）利用灵芝纳米多糖提高主食馒头的品质特性和降血糖作用。通过考察不同比例灵芝纳米多糖添加量对面团的粉质特性、糊化特性以及馒头的质构、风味和感官特性的影响,发现添加5%灵芝纳米多糖的面团吸水率、形成时间、稳定时间和粉质指数分别比对照组上升了5.49%、30.27%、57.69%和78.38%,而弱化度下降了27.27%;峰值粘度、最低粘度、衰减值、最终粘度、回生值和糊化峰值时间分别下降了17.09%、10.12%、8.45%、16.88%、19.31%和8.24%,而糊化温度则上升了4.94%;5%灵芝纳米多糖添加量的馒头硬度、咀嚼性和胶黏性分别比对照组提高了9.63%、23.38%和36.19%,而黏连性和弹性则分别下降19.51%和5.43%。感官评价表明灵芝纳米多糖显著增加了馒头中风味物质的种类和数量,从而提升了馒头的香气和味道。小鼠喂养实验显示,喂食灵芝纳米多糖馒头的小鼠血糖水平比对照组的小鼠血糖水平峰值晚出现30 min,且血糖水平峰值下降了14.03%、14.25%和12.04%。说明含有灵芝纳米多糖的馒头不仅能延缓小鼠餐后血糖水平峰值的出现,而且能降低小鼠餐后血糖峰值。