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目的:过继性细胞免疫治疗(Adoptive cellular immu-notherapy, ACI)是指向肿瘤患者转输具有抗肿瘤活性的免疫细胞(特异性的和非特异性的),以直接杀伤肿瘤或激发机体免疫反应杀伤肿瘤细胞,从而达到治疗肿瘤目的的一种生物治疗方法。近年来,由于综合治疗的合理应用,相当一部分的非霍奇金淋巴瘤可以治愈或缓解,但患者由于长期化疗导致全身情况较差,且出现干细胞受损,外周血管损伤,患者耐受性差,需寻求新的治疗手段。目前,细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine-induced killer cells, CIK)过继免疫治疗已进入临床试验,国内外诸多报道显示其对多种恶性肿瘤均有一定的疗效,是一种很有潜力的免疫细胞治疗方法。CIK细胞是一种增殖速度快,杀瘤活性高,杀瘤谱广的高效免疫活性细胞,并且对正常造血影响轻微,对于促进患者免疫系统的重建、消除残留病变及骨髓净化都具有良好效果。迄今为止,CIK细胞对淋巴瘤细胞株作用的基础研究及在淋巴瘤的临床应用的报道较多,但在淋巴瘤荷瘤鼠体内研究尚少。本试验通过检测应用CIK处理前后Burkitt淋巴瘤荷瘤鼠移植瘤细胞的细胞周期及凋亡的变化,CIK处理前后荷瘤鼠瘤体大小的变化、荷瘤鼠瘤组织bcl-2、Ki-67蛋白表达的差异,研究观察CIK细胞对淋巴瘤荷瘤鼠的抑制作用,并探讨其作用机制,为CIK细胞进一步应用于临床提供理论依据。方法:1肿瘤细胞的传代培养:将Burkitt淋巴瘤Raji细胞加入含10%FBS的1640培养基悬浮,置于37℃、5%CO2,饱和湿度条件下传代培养,取对数生长期的细胞用于实验。2 CIK细胞的制备及体外扩增:取正常人的外周肝素抗凝血,经淋巴细胞分层液密度梯度离心分离外周血单个核细胞(Peripheral bloodMononuclear cell,PBMC),依据不同时间分别加入γ-干扰素(IFN-γ)、抗CD3单克隆抗体(Anti-CD3Mcab)、白细胞介素-2(rhIL-2)等细胞因子,体外诱导成CIK细胞。以上培养细胞常规培养、传代。三天换液时取少量细胞悬液使用血细胞计数板计数并制作增殖曲线。3 MTT法测定CIK细胞对Raji细胞的杀伤作用:将CIK细胞与Raji细胞以不同效靶比(E:T分别为10:1、20:1、40:1),加入96孔板,每组3复孔,常规设相应空白对照,培养24、48小时后,四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法测定分光光度值(OD),计算杀伤活性。4建立荷瘤裸鼠模型并分组:在Balb/c-nu/nu裸小鼠腋下接种Burkitt淋巴瘤Raji细胞1×107ml,0.2ml/只,建立淋巴瘤裸鼠模型。每3天定时用游标卡尺测量移植瘤大小,记录长径和短径,按公式(体积=长径×短径2/2)计算肿瘤体积大小并绘制肿瘤生长曲线。裸鼠成瘤后,将荷瘤鼠随机分为A、B、C 3组(每组各5只):A为生理盐水对照组,B、C均为CIK细胞治疗组,分别在瘤旁注射体外培养14天的CIK细胞,注射量分别为2×107/0.2ml/只,4×107/0.2ml/只,每组均隔日一次,共三次。5杀鼠取瘤并进行相应项目的检测:第7天裸鼠颈椎脱臼处死,剥离肿瘤块并称重,用游标卡尺测量肿瘤的大小,并计算肿瘤的体积,计算肿瘤生长抑制率。机械法处理肿瘤制成单细胞悬液,流式细胞术测定细胞凋亡率,并测定bcl-2、Ki-67蛋白的表达水平。结果:1 CIK细胞对Raji细胞有明显杀伤作用,不同效靶比(10:1,20:1,40:1)的CIK细胞与Raji细胞共同作用不同时间(24h,48h)后,OD值均有不同程度减少,且随着CIK细胞浓度的增加、作用时间的延长,OD值逐渐减小,而CIK细胞对Raji细胞的杀伤作用随之增加,作用时间为24h时CIK细胞对Raji细胞杀伤活性分别为(15.7±1.4)%、(33.8±2.3)%、(49.2±2.1)%;作用时间为48h时杀伤活性分别为(27.9±1.7)%、(59.3±2.0)%、(78.3±1.6)%。相同作用时间不同效靶比之间差异有统计学意义(P<0.05),同一效靶比不同作用时间之间差异也有统计学(P<0.05)。2与生理盐水对照组相比,CIK细胞治疗组荷瘤鼠瘤体均较前缩小,差异有统计学意义(P<0.05),B组抑瘤率为(23.7±0.56)%,C组抑瘤率为(54.3±0.68)%,试验组(B、C)与对照组(A)相比差异均有统计学意义(P<0.05),试验组(B、C)组间比较差异亦有统计学意义(P<0.05)。3荷瘤鼠移植瘤细胞经不同密度的CIK细胞(0、2×107/0.2ml、4×107/0.2ml)作用后,G0/G1期细胞比例随CIK细胞数目的增加逐渐增加(所占百分比分别为28.56±1.69、34.41±0.34、53.43±1.87),同时S期及G2/M期细胞比例逐渐减少, S期所占比例分别为(52.66±4.60)%、(49.62±1.22)%、(34.87±0.67)% , G2/M期所占比例分别为(17.87±0.49)%、(15.43±0.44)%、(11.97±1.23)%,由此得出移植瘤细胞的增殖指数(PI)也随之逐渐降低, A、B、C各组PI分别为(72.18±3.32)%、(64.40±1.31)%、(46.91±0.69)%,试验组(B、C)移植瘤细胞各期所占比例及PI分别与对照组(A)相比差异均有统计学意义(P<0.05),试验组(B、C)组间比较差异亦有统计学意义(P<0.05)。4移植瘤细胞经不同密度的CIK细胞(0,2×107/0.2ml,4×107/0.2ml)作用后,FCM检测移植瘤细胞凋亡,结果显示对照组未见明显的凋亡峰,试验组(B、C)经流式细胞仪测得典型的亚二倍体凋亡峰,随CIK细胞密度的增加,凋亡峰值增加,细胞凋亡率增高,凋亡率分别为(6.19±1.16)%、(13.17±0.17)%,与对照组(0.94±0.87)%相比有统计学差异(P<0.05)。5经过不同密度CIK细胞作用后,由FCM测得移植瘤细胞bcl-2蛋白荧光指数(FI)分别为A:1.00±0.01、B:0.96±0.01、C:0.87±0.02。Ki-67蛋白荧光指数(FI)分别为A:1.00±0.01、B:0.95±0.01、C:0.83±0.02,由此可见移植瘤细胞bcl-2蛋白及Ki-67蛋白表达均较对照组下降,二者与对照组比较均有统计学差异(P<0.05);CIK细胞治疗组间比较亦有统计学差异(P<0.05)。结论:1 CIK细胞对Burkitt淋巴瘤Raji细胞有杀伤活性;且此杀伤活性与CIK细胞数量、共培养时间呈正相关,有明显的剂量-效应和时间-效应依赖关系;2体内抗肿瘤实验结果证实正常人CIK细胞可有效抑制Burkitt淋巴瘤荷瘤鼠移植模型瘤体的生长;3 CIK细胞能够影响淋巴瘤移植瘤细胞周期分布,引起G0/G1期阻滞,从而阻止瘤细胞进入分裂相,使增殖减慢,并且CIK细胞还可以直接诱导肿瘤细胞凋亡;4 CIK细胞在体内对Raji细胞的抑制作用与抑制bcl-2、Ki-67蛋白表达水平有关。