阿胶、黄明胶的分子鉴定及抗氧化活性研究

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胶类中药是以动物的皮、甲、角或骨,用水煎取胶质,浓缩成稠胶状,干燥后制成的固体胶,是传统滋补中药,具有补血,润燥止血等功效,在我国已经有上千年的药用历史。2015年版《中国药典》中收载了阿胶、龟甲胶和鹿角胶,《中华人民共和国卫生部药品标准》中则收载了黄明胶、新阿胶等。近年来,胶类中药的用量急速增长,而药用动物资源日显匮乏,出现了以采用较为低廉的牛皮、猪皮为原料对阿胶进行掺假等现象,不仅危害了公众健康,也引起了市场不公平竞争。因此,本论文研究以胶类中药中存有的动物源特异性肽段及DNA为依据,建立鉴定胶类中药真伪的关键技术,以可靠地检识胶类中药常见伪品及掺伪品;此外,对阿胶和黄明胶经胰蛋白酶水解产生的混合肽进行分离和抗氧化活性研究,活性组分进行MALDI-TOF/TOF-MS分析,以发现潜在的抗氧化活性肽段,有助于阐明胶类中药滋补作用的物质基础,对于含阿胶保健食品的开发及应用具有参考价值。研究内容分为以下几个部分:(1)胰蛋白酶消化—UPLC-ESI-MS鉴定阿胶、黄明胶的动物皮来源以胰蛋白酶对阿胶、黄明胶、新阿胶和马皮胶蛋白质进行酶解,得到肽段混合物,酶解产物进行UPLC-ESI-MS分析,对阿胶、黄明胶的动物皮来源进行鉴定。阿胶的特征离子为m/z 539.80,m/z 539.80(双电荷)→m/z 612.40和m/z 539.80(双电荷)→m/z 923.80作为阿胶专属性检测离子对;黄明胶的特征离子为m/z641.30,m/z 641.30(双电荷)→m/z 726.20和m/z 641.30(双电荷)→m/z 783.30作为黄明胶专属性检测离子对;新阿胶的特征离子为m/z 774.00,m/z 774.00(双电荷)→m/z 977.50和m/z 774.00(双电荷)→m/z 752.30作为新阿胶专属性检测离子对;马皮胶的特征离子为m/z 386.25,m/z 386.25(双电荷)→m/z 556.50和m/z 386.25(双电荷)→m/z 499.25作为马皮胶专属性检测离子对。对照药材及自制样品均具有相应物种的特征离子峰,未出现假阳性或假阴性亦表明自制样品符合标准,可用于后续实验。对市售阿胶、黄明胶进行了检测,结果显示,6批阿胶中有3批仅检出驴皮源肽段,被鉴定为真品;然而另3批检出牛、猪及马皮源肽段,被鉴定为掺伪品;此外,3批黄明胶均仅检出牛皮源肽段,故而被鉴定为真品。(2)MALDI-TOF/TOF-MS分析胶类中药经酶消化后的多肽片段利用胰蛋白酶、胶原酶A对阿胶、黄明胶、新阿胶和马皮胶对照药材及自制样品蛋白质进行酶解,消化产物进行MALDI-TOF/TOF-MS分析,通过比较筛选得出胶类样品特征性多肽片段,以选定的肽段为依据对市售阿胶、黄明胶的动物皮来源进行鉴定。结果表明,经胰蛋白酶消化后,分别从阿胶、黄明胶和新阿胶中筛选出3、17和14个差异性多肽,但是未能从马皮胶中找出特征性肽段;对市售样品进行检测发现,6批阿胶中有4批仅检出驴皮源肽段,被鉴定为真品,然而另2批检出猪皮源肽段,被鉴定为掺伪品;此外,3批黄明胶中2批仅检出牛皮源肽段,被鉴定为真品,另1批检出猪皮源肽段,被鉴定为掺伪品。胶类中药经胶原酶A消化后,主要形成分子量较小的三肽,未能根据MALDI-TOF/TOF-MS分析结果找出可作为专属性鉴定依据的特征性肽段。(3)基于特异性引物扩增鉴定阿胶、黄明胶的动物皮来源根据驴、牛、猪、马四个物种的线粒体基因序列差异,利用Oligo软件设计与筛选出4对物种特异性引物。以SDS裂解—酚仿抽提法提取与纯化阿胶、黄明胶、新阿胶和马皮胶中动物源DNA,优化单重PCR扩增条件并进行特异性验证、灵敏度考察及自制掺伪样品检测,将所建立的技术应用于鉴别市售阿胶、黄明胶的动物源。结果表明,设计筛选得到的4对引物特异性良好,在优化所得的扩增条件下对其他物种无非特异性扩增;最低检测限为0.1 ng/μL,具有较高的灵敏度,并能够检测到阿胶中牛、猪或马源性DNA及黄明胶中的猪或马源性DNA的掺伪量均为10%。此外,对市售阿胶、黄明胶的检测结果显示,6批阿胶中有3批仅检出驴源性DNA被鉴定为真品,另3批检出牛和猪源性DNA,被鉴定为掺伪品;此外,3批黄明胶中1批仅检出牛源性DNA,被鉴定为真品,另1批仅检出猪源性DNA,被鉴定为伪品,还有1批未检出四种动物源DNA。(4)阿胶、黄明胶多肽的抗氧化活性研究利用胰蛋白酶对阿胶、黄明胶进行酶解,消化产物通过RP-HPLC和Sephadex G-50分离;收集所得流份并测定羟基自由基和DPPH自由基清除率,从中筛选出抗氧化活性较高的流份,进行MALDI-TOF/TOF-MS分析,以发现潜在的抗氧化活性多肽。结果表明,抗氧化活性较高的流份主要由分子量较低的肽段组成;对阿胶抗氧化活性流份经RP-HPLC、Sephadex G-50分离和MALDI-TOF/TOF-MS分析,发现潜在的高活性肽m/z为586、904、1048、1077及1466。对黄明胶抗氧化活性流份经RP-HPLC、Sephadex G-50分离和MALDI-TOF/TOF-MS分析,发现潜在的高活性肽m/z为919、1048、1077、1105、1466及2382。
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