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背景宫颈癌是发生在全球女性中第二常见恶性肿瘤,发病仅次于乳腺癌。世界范围内每年约有50万新发病例,其中80%发生在发展中国家。目前已证实,高危型人乳头瘤样病毒(HPV)是宫颈癌发生的最主要危险因素,但仅少数持续性感染最终可能发展成为宫颈癌。HPV感染和宫颈癌的发生具有直接关系,高危型HPV可以与宿主染色体整合,是宫颈早期癌变/癌前病变最直接的始动因素。HPV病毒的E6、E7蛋白可与P53、Rb相互作用,其中E6蛋白通过细胞泛素连接酶E6AP与P53结合,导致抑癌基因P53降解,破坏了P53介导的P14-MDM2-P53途径,失去正常调控引起无限增殖；E7蛋白竞争优先与pRb结合,使pRb与E2F解离,游离E2F增多,导致P16-cyclinD-CDK4/6-pRb-E2F途径调控失调,启动G1-S期进展,引起细胞无限增殖。p16在多数肿瘤中扮演着抑癌基因的角色,由于它的基因突变、缺失或启动子区甲基化,造成p16基因表达下调,参与多种肿瘤的发生和发展。目前,已经有报道显示,p16基因表达异常和宫颈癌发生有密切的关系,但在宫颈癌中,p16基因的作用似乎和大多数肿瘤有着明显的区别。为了进一步探讨p16基因在宫颈癌发生发展中的作用机制,本研究检测p16基因与其它抑癌基因pRb、癌基因c-myc、端粒酶Terc在宫颈癌的表达情况。宫颈癌和其他恶性肿瘤一样,存在着转移和复发的问题,制约着宫颈癌治疗的效果和预后,尤其是中晚期的患者,严重影响患者和生活质量和寿命。自从干细胞学说在近几年被逐渐接受后,肿瘤干细胞的概念也得到大家的重视,目前人们猜测肿瘤干细胞的存在是肿瘤转移和复发的重要原因,而且不断在众多肿瘤特性的研究中发现新的证据。目前认为CSC是肿瘤细胞中具有自我更新、多向分化和成瘤性的特殊细胞亚群,具有放化疗引起的凋亡抵抗性以及高侵袭转移性,不易被常规治疗手段根除,导致肿瘤复发。宫颈癌中的CSC研究也取得了一定的结果,其中的ABCG2+、ALDH+、耐药性、体内成瘤能力等特点和其他组织类型的肿瘤CSC特性类似,而且一些成体或胚胎干细胞的标志物如Oct4、Nanog、Nestin等基因表达明显上调。因此,宫颈癌的CSC可能决定着癌的发生、发展、转移和复发。为了进一步探讨p16基因在宫颈癌发生发展中的作用机制,本研究构建了p16基因shRNA慢病毒载体,建立稳定表达pl6shRNA的细胞系,观察p16基因对宫颈癌干细胞的作用,为p16作为靶点的治疗提供理论依据。材料与方法1.本研究收集了在我院门诊及住院不同程度宫颈病变患者,标本为活检或手术切除后经病理诊断证实。其中宫颈癌患者52例,宫颈病变患者193例,正常对照组40例。2.分别采用免疫组化方法检测了p16蛋白及pRb蛋白,采用FISH方法检测了c-myc基因,Terc基因在正常宫颈组织,癌前病变组织及宫颈癌组织中的表达。3.利用Invitrogene公司的慢病毒载体系统PLenti6/BLOCK-iT-DEST,构建p16基因的小发夹RNA载体,并转染宫颈癌Hela细胞系,建立稳定的p16基因沉默Hela细胞株,用RT-PCR和western-blot方法鉴定p16基因沉默情况。4.体外进行细胞球形成实验,检测Hela细胞球中p16基因表达的变化,以及p16基因沉默后,Hela细胞的细胞球形成情况。5.流式细胞学或western-blot方法检测宫颈癌干细胞标志物CD44、CD24、ABCG2、CK17的表达情况。6.用Transwell和Matrigel观察p16基因沉默后Hela细胞的侵袭能力：用体内实验观察p16基因沉默后,Hela组胞的小鼠体内成瘤能力。结果1. p16蛋白、c-myc基因和Terc基因在慢性宫颈炎、上皮内瘤变(CIN)、宫颈癌病变组织中阳性表达率有明显差异(p=0.000)；随宫颈病变级别的加重,阳性率呈逐渐增高的趋势。pRb在不同宫颈病变组织中蛋白阳性表达率有明显差异(p=0.000),随宫颈病变级别的加重,阳性率呈逐渐降低趋势。2.在宫颈癌的各组临床病理参数分析中可以看出,p16蛋白、pRb蛋白和Terc基因表达与病理分类、临床分期、有无明显转移均无明显相关性(P>0.05),c-myc基因表达随分化程度的加重,组织学分类为G3的c-myc基因阳性表达率高于G2/G1的患者(P<0.05)。3.针对P16基因设计的3个shRNA序列中,经过293FT细胞包装,以及p16基因mRNA和蛋白检测,sh289效果抑制p16基因表达的效果最好,同时pl4ARF基因表达无明显改变。4. Hela细胞无血清培养基进行细胞球培养,获得的细胞球细胞pl6mRNA和蛋白表达均高于Hela母细胞系。5和Hela母细胞系相比,P16基因沉默后,Hela细胞系中CD44+/CD24-、 ABCG2+细胞数量减少,CK17表达改变不明显,成球能力和侵袭能力均降低。6和Hela母细胞系相比,p16基因沉默后,Hela细胞穿过Matrigel的细胞数量减少。体内实验证明,p16基因沉默后,需要更多的瘤细胞才能在裸鼠体内成瘤,同等细胞数量接种裸鼠时,体内肿瘤的体积和重量均低于接种Hela母细胞所形成的肿瘤。结论1.在从慢性宫颈炎、上皮内瘤变(CIN)到宫颈癌病过程中,p16蛋白表达增高是早期事件,在CIN阶段即开始出现明显异常；pRb蛋白阳性率呈逐渐降低趋势；随恶性程度增加,c-myc基因阳性率呈逐渐增高趋势;Terc基因阳性率逐渐增高。2. p16在宫颈癌中高表达,与其它抑癌基因pRb,癌基因c-myc基因、端粒酶(Terc)改变有一定相关性。3. p16基因沉默载体pl6-sh289,具有抑制宫颈癌Hela细胞p16基因表达的作用,不影响p14ARF表达。4. Hela细胞球细胞p16基因表达增高。p16基因沉默可使Hela细胞中CD44+/CD24-、ABCG2+细胞群体数量减少,但对CK17蛋白表达影响不明显。5. p16基因沉默使Hela细胞体外侵袭能力降低,使Hela细胞小鼠体外成细胞球能力和体内成瘤能力下降。