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随着化学农药的大量使用，对环境造成了严重的危害，迫切需要采用生物防治手段来替代。自然界中的农业害虫半数以上属鳞翅目昆虫，而家蚕作为鳞翅目昆虫的模式生物，以其为实验材料进行生物防治的研究无疑有着重要的意义。基于此，本实验室谢洁博士以家蚕几丁质酶作为靶标，在土壤微生物中筛选得到几丁质酶抑制物产生菌Pseudomonas sp.1237＃菌株，该菌株发酵液对家蚕几丁质酶具有强烈的抑制作用。经鉴定该几丁质酶抑制物为一种弹性蛋白酶，命名为Chi-Elastase。通过对Chi-Elastase N-端序列的比较分析，设计引物克隆了该蛋白酶编码基因。在此实验基础上，为了进一步验证Chi-Elastase在生物防治上应用的可行性，本文采用家蚕GAL4/UAS系统对编码该蛋白酶的成熟肽基因Chi-mELastase进行了转基因研究。
另外，本文还对类胡萝卜素结合蛋白基因(CBP)进行了转基因研究。蚕茧的颜色受到相关基因的严格控制，黄、红茧品系茧色以y基因的存在为前提。免疫学分析表明，CBP蛋白只在携带Y基因的家蚕品系中存在，据此推测Y基因可能控制CBP的表达。为了进一步探明CBP基因与Y基因的关系，本研究建立了CBP家蚕转基因系，对CBP基因进行功能分析。
获得的主要结果如下：
1 UAS-Chi-mElastase转基因家蚕品系的建立
本研究利用来源于Pseudomonas sp.1237＃菌株的弹性蛋白酶成熟肽基因Chi-mElastase，构建了转基因载体pBac[3xp3-DsRed+UAS-Chi-mElastase]，通过显微注射蚕卵，获得105个G1蛾区。经过对中后期胚胎的荧光检测，筛选到1个转基因阳性蛾区。经Southem blot分析表明，转基因表达盒已经整合到家蚕染色体上，即UAS-Chi-mElastase转基因家蚕品系构建成功。
2 Chi-mElastase基因表达检测
将获得的UAS-Chi-mElastase转基因系与A3GAL4转基因系杂交，挑选出同时表达红色荧光和绿色荧光的转基因蚕进行Chi-mElastase转基因表达分析。以中肠和表皮cDNA为模板进行RT-PCR分析，结果显示靶基因Chi-mElastase在这两个组织中已经被激活转录。
3 Chi-mElastase抗体制备及转基因蚕蛋白质分析
将Chi-mElastase基因编码区序列亚克隆到pET-28a(+)表达载体，构建重组表达质粒，并将该重组质粒转化BL21菌株。通过IPTG诱导重组菌pET-28a-Chi-mElastase表达蛋白，得到一个约36kD的重组蛋白(其中标签蛋白约6kD，目的蛋白约30kD)，与预测分子量大小相符合。表达条件的优化，发现最佳的诱导条件为37℃、0.6mM/L IPTG诱导6h。
通过亲和层析，切胶及电洗脱纯化原核表达的Chi-mElastase蛋白，免疫小鼠制备抗体。Western blot分析Chi-mElastase蛋白在中肠、表皮和蛹中的表达情况，结果显示中肠、表皮中没有检测到杂交信号，而蛹中有杂交信号的存在。平板透明圈法没有检测到该蛋白酶的抑制活性。
4 Chi-mElastase基因对于家蚕生长发育影响的调查
对UAS-Chi-mElatase转基因系与A3GAL4转基因系杂交后代生长发育情况进行调查。杂交后代根据荧光表达情况分四种情况：既发红色荧光又发绿色荧光，单发红色荧光，单发绿色荧光和不发荧光。各挑取150头，在25℃，相对湿度75％的智能人工气候箱里以人工饲料饲养。观察既发红光又发绿光的转基因蚕生长发育情况，另外三种情况作为对照。结果表明转UAS-Chi-mElatase基因蚕完成了整个生活史，没有出现异常现象，与对照完全一致。
基于所述，本研究获得了Chi-mElastase转基因家蚕，RT-PCR结果显示Chi-mElastase基因已经被GAL4激活转录，Western blot分析表明Chi-mElastase基因正确表达。但没有检测到Chi-mElastase蛋白的几丁质酶抑制活性，也没有观察到该基因对家蚕生长发育的影响，转基因家蚕完成了整个生活周期，与对照相比，并无明显差异。本研究结果显示，Chi-Elastase在生物防治上应用的渠道甚至可行性，尚需进一步探讨。
5 CBP基因转家蚕表达研究的实验结果
本研究将CBP基因分别与BmStart1基因上有调控序列(pBmStart1)、CBP基因上游调控序列(pCBP)及IE1启动子构建成3个转基因表达载体。注射蚕卵后，分别获得139个、31个和51个G1蛾区。经过对中后期胚胎的荧光检测，分别获得5个、1个和1个转基因阳性蛾区。经过Southern blot及RT-PCR分析表明，3个转基因表达盒都已经整合到家蚕染色体上，并都进行了转录，CBP基因的表达量在IE1CBP转基因系中最高，在pcBPCBP转基因系中次之，在pBmStart1CBP转基因系中最低。我们观察了CBP转基因家蚕的黄血黄茧性状恢复情况，发现除了pBmStart1CBP转基因系外，另外两个转基因系都恢复了部分黄血黄茧性状，恢复程度与RT-PCR结果一致。这些研究结果表明，类胡罗卜素结合蛋白(CBP)是Y基因的产物。