甾类化合物11β-羟基甲羟孕酮微生物脱氢新工艺研究

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底物4-烯-6α-甲基-3,20-二酮-11β,17α-二羟基孕甾(即11β-羟基甲羟孕酮)的C1,2位脱氢是合成甲基泼尼松龙的关键步骤之一。与化学方法相比,采用微生物法脱氢,具有反应条件温和、专一性强以及转化率高等优点。由简单节杆菌催化11β-羟基甲羟孕酮C1,2位脱氢反应过程如下:针对甾类药物微生物脱氢反应中遇到的底物在水相中的低溶解性,以及产物(或底物)抑制作用,本文对简单节杆菌催化的11β-羟基甲羟孕酮脱氢新工艺进行了研究,以微乳体系或含离子液体体系为反应介质,对体系组成及工艺优化等方面进行了研究。论文对以微乳为反应介质的体系的组成及影响因素进行了研究,结果表明:直接以菌体培养液作为水相;采用7%(体积分数)的95%乙醇溶解底物投料;水相中加入4 g/L的Tween-80作为表面活性剂;豆油作为油相加入水相,加量为10 g/L。由吐温-80/乙醇/豆油/培养液组成的简单微乳体系在33℃最适反应温度下,当底物浓度为4 g/L时,微乳体系中的脱氢转化率为88.6%,较水相直接投料转化提高了66.2%。构建了Tris-HCl缓冲液/甲苯两相体系,在两相体系的水相中引入亲水性离子液体作为共溶剂,对5种亲水性离子液体[Bmim](L)Lac、[Bmim]BF4、[Emim]BF4、[Hmim]BF4、[Bmim]OTF的研究发现:[Bmim](L)Lac作为共溶剂加入水相,对菌体的生长活性、菌体内脱氢酶活性及底物在水相中的溶解性都有较大的提高;[Bmim](L)Lac的最适加量为水相缓冲液的2%(w/v);当水相菌体含量为50 g/L,底物浓度10 g/L时,在含2%[Bmim](L)Lac的水-甲苯两相体系中,生物转化16 h,底物11β-羟基甲羟孕酮的脱氢转化率可达80.9%。对亲水性离子液体体系中11β-羟基甲羟孕酮的脱氢反应进行进一步研究。研究离子液体的阴阳离子对脱氢反应的影响,发现水相中加入2%[Bmim]BF4和10g/L乳酸钙,游离菌体细胞对底物的脱氢转化率为80.2%,达到了与2%[Bmim](L)Lac相同的水平;以海藻酸钙/聚乙二醇固定化得到的细胞在上述反应体系中底物的脱氢转化研究表明:固定化细胞的最适添加量为1.00 g/mL;转化时间以16h为宜;当底物浓度10 g/L,脱氢转化率达到87.12%。
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