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研究背景和目的慢加急性乙型肝炎肝衰竭(Acute-on-Chronic Hepatitis B Liver Failure,ACHBLF)是在慢性乙型病毒性肝炎(Chronic hepatitis B,CHB)感染的基础上发生肝功能的急性失代偿,导致肝脏合成、排泄、解毒和生物转化等功能障碍,表现为凝血功能障碍、高胆红素血症、肝性脑病、肝肾综合征、腹水等临床症候群,其具有病情进展迅速、预后极差、死亡率极高、病理生理学机制尚待阐明等特点。鉴于以上背景,近些年有学者提出了肝衰竭前期(Pre-liver failure,pre-LF)这一临床类型。肝衰竭前期则是在CHB进展至肝衰竭过程中的前期阶段,然而其具体诊断标准尚存争议。由于我国以CHB感染为主的流行病学特点,我们主要研究慢加急性乙型肝炎肝衰竭前期(Acute-on-Chronic Hepatitis B pre-Liver Failure,pre-ACHBLF)这一临床类型。因此我们定义符合“血清总胆红素(Total bilirubin,TBIL)≥171umol/L,凝血酶原活动度(Prothrombin activity,PTA)>40%”标准的患者符合pre-ACHBLF的诊断。对肝衰竭前期患者进行早期预警、早期干预及治疗,那么将会有效地降低肝衰竭的发生率及死亡率。本研究旨在通过检测pre-ACHBLF 患者的外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cells,PBMCs)中谷胱甘肽巯基转移酶P1(Glutathione-S-transferaseP],GSTPl)基因启动子的甲基化状态,进而探究GSTP1甲基化在pre-ACHBLF患者预后中的预测价值。方法本次研究共纳入了 103例pre-ACHBLF患者、80例CHB患者和30例健康志愿者作为正常对照(Healthy controls,HCs)。通过甲基化特异性聚合酶链式反应(Methylation-specific polymerase chain reaction,MSP)和实时定量聚合酶链式反应(Real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)来探究 PBMCs中GSTP1基因启动子区域的甲基化状态及其mRNA表达水平。通过酶联免疫吸附实验(Enzyme-linked immunosorbent assay,Elisa)检测血清中还原型谷胱甘肽(Reduced glutathione,GSH)、丙二醛(Malonaldehyde,MDA)、黄嘌吟氧化酶(Xanthine oxidase,XOD)的水平来评估pre-ACHBLF的氧化应激状态。所得数据运用SPSS v22.0软件进行统计学分析。结果1.Pre-ACHBLF 患者 PBMCs 中 GSTP1 启动子甲基化率(35/103,33.98%)显著高于 CHB 组(2/80,2.50%;χ2 =27.664,P<0.001)和正常对照组(0/30,0.00%;χ2= 13.835,P<0.001),然而,CHB患者与正常对照之间则无明显统计学差异(χ2= 0.764,P=0.382)。2.Pre-ACHBLF患者PBMCs中GSTP1基因的mRNA表达水平明显低于CHB患者(Z =-7.602,P<0.001)和正常对照(Z =-5.858,P<0.001),且 CHB 组也明显低于正常对照组(Z =-2.623,P = 0.008),差异均具有统计学意义。3.Pre-ACHBLF 患者 GSTP1 的 mRNA 水平与 PTA(r =0.277,P<0.05)明显正相关,与TBIL(r=-0.315,P<0.01)和INR(r=-0.315,P<0.01)明显负相关,而与 HBsAg、HBeAg、HBVDNA、ALT、AST、ALB、Cr和MELD 积分不具有明显相关性(P均>0.05)。4.与CHB相比较,pre-ACHBLF患者血清中MDA和XOD的水平显著增高(231.370±133.286 nmol/ml vs 138.173±92.087 nmol/ml,P<0.001;40.599±22.890 ng/ml vs 22.675±17.442 ng/ml,P<0.001),并且 GSH 的水平显著降低(76.434±37.736 nmol/ml vs 93.290±39.455 nmol/ml,P= 0.015)。Pre-ACHBLF 患者中,与非甲基化组相比,甲基化组具有较高的MDA和XOD水平(264.333±145.339 nmol/ml vs 200.878±114.614 nmol/ml,P= 0.042;44.854±24.517 ng/ml vs 36.663±20.812 ng/ml,P=0.159),和降低的 GSH 水平(64.686±29.038 nmol/ml vs 87.300±41.768 nmol/ml,P= 0.013)。5.当用于预测pre-ACHBLF患者前1、2、3个月肝衰竭发生率时,GSTP1甲基化的受试者工作特征曲线下面积(Area under the receiver operating characteristic curves,AUCs)分别为 0.825、0.804 和 0.767,明显优于 MELD 积分(AUC 分别为0.589、0.622和0.602),且差异均具有统计学意义(P均<0.05)。结论1.在pre-ACHBLF患者的PBMCs中,存在GSTP1基因启动子的异常甲基化,并且,其甲基化率显著高于CHB患者和HCs,相应的,pre-ACHBLF组mRNA表达水平则明显低于CHB组和HCs;2.Pre-ACHBLF患者GSTP1的mRNA表达水平与PTA明显正相关,与TBIL和INR明显负相关,提示GSTP1启动子甲基化状态与pre-ACHBLF患者疾病的严重程度具有相关性;3.在pre-ACHBLF患者中,与非甲基化组相比较,甲基化组的MDA和XOD水平升高、GSH水平降低,提示pre-ACHBLF患者中存在氧化应激,且DNA甲基化状态的异常与氧化损伤相关;4.GSTP1基因启动子的甲基化对pre-ACHBLF患者前1、2、3个月的肝衰竭发生率具有较好的预测价值,且优于MELD积分,提示GSTP1基因甲基化可作为预测pre-ACHBLF疾病进展有效的非侵入性的生物标志物,为肝衰竭前期预后的判断提供思路,通过早期预警及干预,进而降低肝衰竭的发生率和死亡率。