研究背景冠心病是一种发病率、死亡率和致残率极高的常见病和多发病,严重威胁人类健康,已成为严重的社会公共卫生问题之一。心肌缺血发生时,能够及时、有效地恢复缺血心肌的血流灌注,是减少缺血心肌损伤和恢复心脏功能的重要措施之一,也是改善缺血性心脏病患者预后的关键。随着对急性心肌梗死(acute myocardial infarction, AMI)患者进行溶栓治疗、急症经皮穿刺冠状动脉介入治疗术(percutaneous coronary intervention, PCI)、冠状动脉旁路移植术(coronary artery bypass grafting, CABG)和激光心肌血运重建术等技术在临床上的推广应用,使缺血心肌的血液灌注得以及时有效的恢复。大量基础和临床研究[1,2]证实,缺血心肌的再灌注本身也会诱发一系列新的病理生理变化,进一步加重心肌组织细胞的损伤,出现再灌注心律失常、心肌舒缩功能障碍、代谢异常以及心肌超微结构改变等,即发生心肌缺血再灌注损伤(myocardial ischemia reperfusion injury,MIRI),直接影响患者的心脏功能和预后。心肌缺血再灌注(ischemic reperfusion, I/R)损伤是极其复杂的病理生理过程,即缺氧器官在恢复血流和氧输送的情况下心肌损伤加剧的现象。在血液中氧气和营养缺乏的条件下,恢复血流灌注的结果就是通过氧化应激诱导炎症和氧化还原损伤而不是恢复器官的正常功能[3]。多种因素包括氧自由基损伤、ATP敏感性钾通道、钙离子负荷超载、能量代谢障碍、细胞凋亡及血管内皮细胞功能失调等参与了MIRI的病理生理过程。减轻缺血所致的心肌细胞死亡(坏死和凋亡)的最有效途径就是恢复心肌的有效血流灌注,但再灌注本身可以导致心肌再灌注损伤。因此,明确MIRI的机制,对减轻或者消除MIRI具有重要的临床意义。高迁移率族蛋白1[high mobility group protein box 1, HMGB1)是一种古老的生物分子,由215个氨基酸残基组成,其相对分子量为30KD。有3个独立的结构域(A盒、B盒、C盒),均由约80个氨基酸残基组成,是结合DNA的功能结构域,位于N端的A盒和B盒与DNA都有很高的亲和力。A盒、B盒均带有正电荷,而位于C端的C盒则完全带负电荷；B盒同时也是HMGB1引起炎症反应的功能性结构域。HMGB1在哺乳类之间具有99%的同源性,在进化上具有高度保守的特点[4]。研究表明：在正常生理状态下,HMGB1表达于绝大多数的器官和组织,属于非组蛋白的核蛋白。在生理状态下,HMGB1位于生物体的细胞核内,并参与某些基因的转录、表达及细胞分化的调控过程,但HMGB1本身不是基因的核转录因子[5]。在正常生理情况下,HMGB1在细胞核内与DNA的结合是松散的,但当细胞遭受机械损伤或坏死的时候(而非细胞凋亡),HMGB1易于从受损的细胞核内释放到细胞外,继而诱发炎症反应。因此,HMGB1被认为是机体坏死细胞发出的内源性的危险信号。多种免疫细胞,如巨噬细胞在炎症发生后可主动分泌HMGB1,一些感染性刺激因子(如LPS)和非感染性刺激因子(如TNF-α、IL-1β)均可刺激免疫细胞分泌HMGB1。近年来的研究表明：HMGB1能够抑制衰竭心脏的心肌重构[6],给予HMGB1治疗可改善心功能、减少心肌梗死面积[7]。与缺血再灌注组相比,给予外源性HMGB1进行预适应可使心肌酶LDH.CK、肿瘤坏死因子-α(timor necrosis factor-α, TNF-α)、白细胞介素-6(interleukin-6, IL-6)和梗死面积显著降低[8]。亦有研究表明：机体内源性的HMGB1可促进心肌梗死大鼠心肌血管新生和心功能的恢复。心肌梗死后给与外源性的HMGB1可通过心肌细胞再生使左室功能得到一定程度的恢复；内源性HMGB1在糖尿病大鼠缺血性血管再生过程中具有决定性作用,给予外源性HMGB1蛋白可通过VEGF依赖方式促进糖尿病鼠缺血后肢侧支循环的形成[9]。提示HMGB1可以减轻心室重构、促进心肌细胞再生,对缺血心肌具有保护作用,从而使心功能得到改善。但也有研究表明：HMGB1表达增加与阿霉素所致心肌细胞凋亡有关,应用药物(A-box)或从遗传角度阻止HMGB1表达能够减轻阿霉素所致的心肌细胞凋亡和心功能不全[10]。心肌细胞源性HMGB1可通过JNK通路促进I/R诱致的在体心肌细胞凋亡和体外培养心肌细胞的缺氧复氧所致的细胞凋亡。此外,处于缺氧／复氧条件下的心肌细胞释放的HMGB1参与心肌细胞TNF-a的生成,继之HMGB1与其心肌上的Toll样受体4(toll like receptor 4, TLR4)结合,HMGB1与TNF-a通过活化JNK通路导致心肌细胞凋亡[11]。上述研究提示：HMGB1可参与药物和I/R所致的心肌细胞凋亡,并促进心功能的恶化。我们的研究表明：大鼠心肌I/R发生后,其心肌HMGB1蛋白表达明显高于假手术组,而给辛伐他汀预处理后,I/R组大鼠心肌HMGB1表达明显下降[12]。临床研究表明：不稳定性心绞痛／非ST段抬高性心肌梗死(UA/NSTEMI)患者发病24小时内,血清HMGB1升高。入院时血清HMGB1升高是UA/NSTEMI患者心血管原因死亡的独立预测指标[13]。我们的研究表明：AMI患者入院时,血清HMGB1明显高于不稳定性心绞痛组和对照组,血清HMGB1含量与冠心病患者疾病严重程度正相关,HMGB1升高是AMI患者预后不良的独立预测指标之一[14]。我们应用辛伐他汀对AMI大鼠进行后适应的研究发现,在再灌注前静脉给予辛伐他汀可以引起AMI大鼠心肌损伤标志物和氧化应激标志物的下降、心肌梗死面积的减少；AMI可使大鼠心肌HMGB1的表达增加,辛伐他汀后适应可以显著降低大鼠心肌HMGB1的表达,并与剂量呈正相关,提示降低HMGB1的比表达可对再灌注心肌产生保护作用[15]。也有研究表明：HMGB1对大鼠心肌梗死的作用具有剂量依赖性,大剂量可使心功能恶化,小剂量可以改善心功能[7]。外源性HMGB1可能通过TGF-p/SMDA信号通路防止心肌梗死后心肌发生不良重构[16]。总之,目前对外源性HMGB1对缺血心肌的作用尚无定论。磷脂酰肌醇-3-激酶／丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶(Phosphoinositide 3-kinase/ protein kinase B, PI3K/Akt)通路是机体内重要的信号转导通路之一。已证实P13K/Akt信号通路在细胞的存活、凋亡以及增殖等活动中发挥重要的生物学功能[17],激活P13K/Akt信号传导通路可以有效地阻止心肌细胞凋亡,保护心肌免受I/R损伤[18]。前期研究亦经证实激活PDK/Akt信号传导通路可以调节HMGB1的表达[19]。PI3K/Akt信号通路参与了HMGB1预适应对MIRI的保护作用[20]。已有研究证明：外源性HMGB1也可以通过TGF-β/SMDA信号通路防止心肌梗死后心肌发生不良重构。近期研究表明,抑制HMGB1表达可以减轻心肌I/R造成的心肌损伤和细胞坏死,但是给予外源性的HMGB1可以加重MIRI损伤[21]。因此,外源性HMGB1对I/R心肌的作用如何,调控其作用的信号传导通路是什么,值得进一步研究。前期的研究多在梗死心肌局部注射HMGB1,该途径给药需开胸创伤大,并发症多,其研究结果不适于临床研究借鉴,且其结果与静脉注射是否存在差异等尚未明了。因此,本研究拟构建大鼠心肌I/R模型,经静脉给予HMGB1,探讨静脉HMGB1对I/R心肌的作用,并探讨其信号传导通路。本研究共分两分部进行：第一部分HMGB1对大鼠心肌缺血再灌注损伤的作用；第二部分PI3K/Akt信号通路介导HMGB1对大鼠心肌缺血再灌注损伤作用的调控机制。第一部分：HMGB1对大鼠心肌缺血再灌注损伤的作用研究目的通过构建在体大鼠急性心肌I/R模型,观察不同剂量的静脉HMGB1对I/R大鼠心肌的作用。主要观察：(1)HMGB1对IL-6、TNF-α和心脏肌钙蛋白I(cardiac tropnin I,cTNI)等炎症和心肌损伤标志物的影响；(2)观察心肌组织丙二醛(malonaldehyde, MDA)和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)等氧化应激产物的改变；(3)对心肌梗死面积和心肌细胞凋亡率的影响,以探讨不同剂量的HMGB1对大鼠MIRI损伤的作用。研究方法取雄性Wistar大鼠(体重250g-300g),随机分为假手术组(Sham,n=15)、缺血再灌注组(I/R, n=15)、I/R+HMGB50组(HMGB50,50ng/kg, n=15)、I/R+ HMGB 100组(HMGB100, 100ng/kg, n=15)、I/R+HMGB200 (组 HMGB200, 200ng/kg, n=15)共5组。I/R+HMGB1各组结扎心脏冠脉前降支(left anterior descending, LAD) 30min后,再灌注4h,分别按照HMGB150ng/kg,100ng/kg和200ng/kg的剂量溶于0.5ml生理盐水中,于再灌注前10min经尾静脉注射。Sham组只放置结扎线,不结扎LAD血管。于再灌注4h后,进行下述测定：1、酶联免疫吸附法(enzyme link immunosorb assay, ELISA)测定血清IL-6、TNF-α、cTnI和心肌组织MDA含量和SOD活性；3、心肌梗死范围测定；2、病理学观察(H.E.染色)；4、TUNEL(Terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick-end-labeling, TUNEL)法检测心肌细胞凋亡。研究结果1、如图1所示：图1(a)为正常心电图表现,为窦性心律。结扎LAD30min后,心动图ST段弓背上抬,提示LAD结扎成功[图1(b)]所示。松开结扎线,恢复LAD再灌注后,出现室性心律失常,即再灌注心律失常[图1(c)]所示。I/R组大鼠中共有8只(53.3%)发生室性早搏,2只发生心室颤动(未完成实验,剔除未统计)。HMGB1干预各组室性心律失常的发生率下降(p<0.05):HMGB50组7只(46.7%)出现室性早搏,1只发生心室颤动；HMGB100组6只(40.0%),2只发生心室颤动；HMGB200组6只(40.0%),1只发生心室颤动。所有发生心室颤动的大鼠均死亡,未列入研究统计,最后各组完成实验的各组大鼠均为15只。表明HMGB1干预可以减少I/R大鼠室性心律失常的发生(p<0.05)2、如表1(a-e)和图(2-6)所示,I/R组血清IL-6(377.46±16.86/166.87±15.45pg/ml)、TNF-α(77.23±1.01/16.68±2.57 pg/ml)、cTnl (78.46±8.6/0.13±0.12 μg/l)和心肌MDA含量显著高于sham组(8.59±0.71/1.48±0.17nmol/mg,均p<0.01)；心肌SOD活性明显低于sham组(71.33±±5.81/140.77±±10.55u/mg,p<0.01)。与I/R组比较,HMGB50、HMGB100和HMGB200各组血清IL-6(296.97±24.08、271.05±±16.94和227.62±16.22 pg/ml,均p<0.01)、TNF-a(58.62±5.83、52.69±6.74和45.7±8.71 pg/ml,均p<0.01)、cTnI(66.26±6.87、58.74±±7.05和52.40±6.70μg/l,均p<0.01)和心肌MDA(6.81±1.43、5.50±0.88和3.88±1.12 nmol/mg,均p<0.01)含量显著降低,心肌SOD含量(83.47±5.75、92.55±6.01和117.26±10.31 u/mg,均p<0.01)明显升高,并呈剂量依赖性。3、如表1(f)和图8所示,与I/R组[(56.30±4.47)%]比较,HMGB50、 HMGB100和HMGB200各组心肌梗死面积[(45.80±4.37)%、(40.60±5.04)%和(34.10±5.99)%,均p<0.01]明显降低。如图7所示,正常灌注心肌呈蓝色、缺血危险区心肌呈砖红色、梗死区心肌呈白色。4、如图9所示,I/R组心肌纤维紊乱,梗死区心肌细胞核溶解。各HMGB1处理组上述改变明显减轻,剂量越大,改变越轻微。5、如表1(g)和图(10-11)所示,I/R组心肌细胞凋亡率显著高于sham组[(29.09±2.41)%/(5.43±1.58)%,p<0.01]。与I/R组相比,HGB50、HMGB100和HMGB200各组心肌细胞凋亡率[(29.09±2.41)%/(24.90±4.43)%、(16.04±1.99)%和(13.39±1.64)%,均p<0.01]下降,HMGB1剂量越高,细胞凋亡率越低。结论1、心肌缺血再灌注损伤表现为心肌细胞严重坏死,心肌纤维结构紊乱,炎性细胞浸润；血清IL-6、TNF-a和c-TnI等心肌炎症和损伤标志物升高；心肌MDA含量升高和SOD含量下降等氧化应激产物变化。2、HMGB1可以减轻心肌缺血再灌注损伤,对心肌产生保护作用。抑制炎症反应和减轻氧化应激、抑制心肌细胞凋亡,可能是HMGB1减少心肌梗死面积,对缺血再灌注心肌损伤保护的作用机制之一。第二部分：PI3K/Akt信号通路介导HMGB1对大鼠心肌缺血再灌注损伤保护的调控机制研究目的构建在体大鼠急性心肌I/R模型,观察静脉注射HMGB1对心肌I/R大鼠血清IL-6、TNF-α、c-TnI和心肌组织MDA含量、SOD活性及其心肌梗死面积的影响。探讨静脉HMGB1对大鼠再灌注心肌的保护作用,并应用P13K抑制剂渥曼青霉素(Wortmannin),探讨PI3K/Akt信号通路介导HMGB1保护心肌缺血再灌注损伤的调控作用及其机制。研究方法取雄性Wistar大鼠(体重250g-300g),随机分为五组,即假手术组(Sham,n=20)、缺血再灌注组(I/R,n=20).I/R+HMGB200组(n=20).I/R+Wortmannin组(I/R+Wortmannin,n=20).I/R+HMGB200+Wortmannin组(I/R+HMGB200 +Wortmannin,n=20).I/R+HMGB200组：结扎LAD 30min,再灌注4h;HMGB1(200ng/kg)溶于0.5ml生理盐水中,分别于再灌注前10min注射HMGB1和15min尾静脉注射0.5ml生理盐水；I/R+Wortmannin组：结扎LAD 30min,再灌注4h,渥曼青霉素(20μg/kg)溶于0.5ml二甲基亚砜中,再灌注前10min和15min分别尾静脉注射0.5ml生理盐水和渥曼青霉素；I/R+HMGB200+Wortmannin组：结扎LAD 30min,再灌注4h。HMGB1(200ng/kg)和渥曼青霉素(20μg/kg)分别溶于0.5ml生理盐水和二甲基亚砜中,分别于再灌注前10min和15min尾静脉注射。再灌注4h后：1、ELISA法测定血清IL-6、TNF-α、cTnI含量,并测定心肌组织中MDA和SOD含量；2、TTC方法测定心肌梗死面积；3、病理学观察(H.E.染色)；4、TUNEL法检测心肌细胞凋亡；5.Westen blotting测定t-Akt、p-Akt、缺氧诱导因子-1α(hypoxic inducible factor-1α,HIF-1α)和血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)蛋白的表达。再灌注4h后,各组大鼠均留取4只存活四周后做下述检测：1、超声心动图观测心功能的变化；2.Masson染色观测心肌纤维化的程度。研究结果1、各组血清IL-6、TNF-α、cTNI和心肌组织MDA含量和SOD活性的比较：如表1(a-e)和图(1-5)所示,I/R组、I/R+HMGB200组、I/R+Wortmannin组和 I/R+HMGB200+Wortmannin组血清IL-6(377.46±16.86 pg/ml,227.62±16.22 pg/ml, 363.45±11.59 pg/ml and 363.28±11.42 pg/ml).TNF-α(77.23±1.01 pg/ml,45.70± 8.71 pg/ml,74.32±1.42 pg/ml and 76.35±3.35 pg/ml).cTnI(78.46±8.60 ng/ml, 52.40±6.70 ng/ml,73.53±4.53ng/ml and 77.58±6.24 ng/ml)和MDA(8.59±0.71 nmol/mg,3.88±1.12 nmol/mg,7.04±0.53 nmol/mg and 9.04±0.42 nmol/mg)显著高于Sham组,SOD含量降低(71.33±5.81 u/mg,117.26±10.31 u/mg,68.43±3.55 u/mg and 75.28±7.53 u/mg,均P<0.01).I/R组(377.46±16.86 pg/ml,77.23±1.0 pg/ml,78.46±8.60 ng/ml,8.59±0.71 nmol/mg)、I/R+Wortmannin组(363.45±11.53 pg/ml,74.32±1.42pg/ml, 73.53±4.53ng/ml,7.04±0.53 nmol/mg)和I/R+HMGB200+Wortmannin组 (363.28±11.42 pg/ml,76.35±3.35 pg/ml,77.58±6.24 ng/ml,9.04±0.42 nmol/mg)血清IL-6、TNF-α、cTNI和心肌MDA含量显著高于I/R+HMGB200组(227.62±16.22 pg/ml,45.70±8.71 pg/ml,52.40±6.70 ng/ml,3.88±1.1 nmol/mg)(均p<0.01),SOD含量显著低于I/R+HMGB200组(71.33±5.81 u/mg,68.43±3.55u/mg and 75.28±7.53 u/mg,vs 140.77±10.55 u/mg,均P<0.01)；I/R组与I/R+HMGB200+wortmannin组相比无明显差异。2、各组大鼠心肌梗死面积的比较：如图(6-7)和表1(f)所示,与I/R组[(56.30±4.47)%],I/R+wortmannin组[(55.35±5.25)%]和I/R+HMGB200+wortmannin组[(53.55±3.25)%]比较,I/R+HMGB200处理组心肌梗死面积[(34.10±5.99)%]明显降低(均P<0.01)；I/R组与I/R+HMGB200+wortmannin组比较无明显差别。3、HE染色观察结果：如图8所示,sham组可见心肌组织中无炎细胞浸润,心肌纤维排列规则；I/R组,I/R+wortmannin组和I/R+HMGB200+wortmannin组可见有大量炎细胞浸润,心肌细胞水肿,肌纤维溶解断裂；HMGB1处理组可见有少量炎细胞浸润,肌纤维排列大致正常。4、各组心肌细胞凋亡结果：如图(9-10)和表1(g)所示,与sham组[(5.43±1.58)%]相比,I/R组[(29.09 ±2.41)%]、I/R+HMGB200组[(13.39±1.64)%]、I/R+wortmannin组[(25.64±3.53)%]和I/R+HMGB200+wortmannin组[(27.13±3.53%]心肌细胞凋亡率显著增加(均p<0.01)。I/R+ wortmannin组[(25.64±3.53)%]和I/R+HMGB200+wortmannin组[(27.13±3.53)%]心肌细胞凋亡率明显高于I/R+HMGB200 [(13.39 ± 1.6)%](均p<0.01)。5、如图11所示p-Akt、HIF-1α和VEGF蛋白表达的比较：与sham组比较,I/R组、I/R+HMGB200组、I/R+wortmannin组和I/R+ HMGB200+wortmannin组p-Akt、HIF-1α和VEGF蛋白的表达显著增加(p<0.01)；与I/R组比较,I/R+wortmannin组p-Akt、HIF-1α和VEGF蛋白的表达显著增加(p<0.01),I/R+wortmannin组和I/R+HMGB200+wortmannin组与I/R组无明显差异。与I/R+HMGB200组比较,I/R+wortmannin组和I/R+HMGB200+wortmannin组p-Akt、HIF-1α和VEGF蛋白表达明显降低(P<0.01)。6、超声心动图心功能参数的变化：如图(12-15)和表1(h-k)所示,与sham组相比,I/R组左室收缩期内径(LVIDs) (5.55 ± 1.13 mm vs 4.11 ± 0.85 mm, p<0.01)、左室舒张期内径(LVIDd) (6.61 ± 0.85 mm vs 4.04 ± 0.28 mm, p<0.01)、左室舒张末期容积(LVEDV) (0.71 ± 0.16 ml vs 0.41 ± 0.02 ml, p<0.01)、左室收缩末期容积(LVESV) (0.50 ± 0.22 ml vs 0.28 ± 0.07 ml, p<0.05)和左室质量指数(LV Mass) (1.43 ± 0.11 g vs 1.13 ± 0.08 g, p<0.01)明显增加,左室射血分数(LVEF)(46.68±3.92%vs 89.90±7.13%,p<0.01)和左室缩短分数(FS)(37.90±13.07%vs 77.09±5.64%,p<0.01)显著下降。与I/R组相比,I/R+HMGB200组左室收缩期内径(LVIDs)(4.48±0.60mmvs 5.55±1.13mm,p<0.01)、左室舒张期内径(LVIDd)(5.07±0.64 mm vs 6.61±0.85mm,p<0.05)、左室舒张末期容积(LVEDV)(0.54±0.10 ml vs 0.71±0.16 ml,p<0.01)、左室收缩末期容积(LVESV)(0.29±O.12 ml vs0.50±0.22 ml,p<0.05)和左室质量指数(LV Mass)(1.20±0.11 g vs 1.43士0.11 g,p<0.01)明显降低,左室射血分数(LVEF)(77.39±4.98% vs 46.68±3.92%,p<0.01)和左室缩短分数(FS)(59.71±13.40%vs 37.90±13.07%,p<0.01)增加。与I/R+HMGB200组相比,I/R+wortmannin组和I/R+HMGB200+wortmannin组左室收缩期内径(LVIDs)(4.48±0.60 mm vs 6.28士0.64 and 5.89±0.59 mm,均p<0.01)、左室舒张期内径(LVIDd)(5.07±0.64 mm vs 6.73士0.78 mm 和6.21士1.0 mm,p<0.01、p<0.05)、左室舒张末期容积(LVEDV)(0.54±O.10 ml vs 0.78士0.06 ml和0.72±0.12 ml,p<0.01)、左室收缩末期容积(LVESV)(0.29±0.12 mlvs 0.45±0.07 ml和0.43±0.11 ml,p<0.05)和左室质量指数(LV Mass)(1.20±0.11 g vs 1.50±1.17 g和1.41±0.44 g,均p<0.01)明显增加,左室射血分数(LVEF)(77.39±4.98%vs 42.88±6.36%和45.87±6.22%,p<0.01)和左室缩短分数(FS)(59.71±13.40%vs 25.02±3.49%和39.70±8.43%,p<0.01)显著降低。7.Masson染色观测心肌纤维化的程度：如图(16-17)和表1(1)所示,与sham相比,I/R组心肌CVF明显增加(1.29±0.41%vs 35.31±3.92%,p<0.01)。与I/R组比较,I/R+HMGB200处理组CVF值明显下降(35.31±7.92% vs 10.94±1.54%,p<0.01)。与I/R+HMGB200处理组相比,I/R+wortmannin组和I/R+HMGB200+wortmannin组CVF值显著升高(10.94±1.54%vs 34.10±2.76%和29.02±2.01%,均p<0.01)结论1、心肌缺血再灌注损伤表现为心肌细胞坏死、血清心肌损伤标志物cTnI和血清炎症因子(如IL-6和TNF-α)以及氧化应激产物MDA升高、心肌纤维结构紊乱、心肌纤维化以及p-Akt、HIF-1α和VEGF蛋白表达降低和心功能下降。2、静脉HMGB1干预可以减轻心肌缺血再灌注损伤,表现为心肌梗死面积缩小、心肌细胞凋亡率下降、心肌损伤标志物降低、心肌组织p-Akt、HIF-la和VEGF蛋白表达增加、心肌纤维化明显减轻,从而对缺血再灌注心肌产生保护作用。3、PI3K/Akt信号通路的激活介导了HMGB1对心肌缺血再灌注损伤保护的调控。