蛛网膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage, SAH)是发病率仅次于脑梗死和脑出血的第三位急性脑血管疾病。绝大多数SAH系脑动脉瘤破裂所致,其病死率在过去的30年中下降了17%,存活率达65%,但50-60%的幸存患者中仍存在长期的不同程度的认知功能障碍和行为改变,以记忆、执行力和语言能力下降为主,影响工作和生活,给社会和家庭带来沉重负担。认知功能障碍被认为是SAH后继再出血、脑血管痉挛后最具破坏性的并发症。也是部分患者临床应用内皮素受体拮抗剂Clazosentan治疗脑血管痉挛却仍不能明显改善症状的原因之目前SAH后认知功能障碍的发病机制说法不一,(?)rbo M等研究认为出血量和发病时的急性严重程度不是认知损害的主要决定因素,而并发症如迟发性痉挛、慢性颅高压等可能发挥了更大的作用;Haug T等则发现认知损害与SAH术后痉挛无关,在患者脑血管痉挛已经恢复1年后仍有迟发性的认知损害出现。还有观点支持SAH早期全面性脑损伤(包括颅高压、血脑屏障破坏、脑水肿、脑血流量下降、氧自由基损伤等)及慢性炎症机制。因此需要进一步明确其病理生理机制。目前这方面的动物实验研究较少。Jeon H等研究证实蛛网膜下腔出血后海马神经元有损伤,主要表现为凋亡,但大部分神经元形态完整,损伤程度相对较轻,不足以解释SAH大鼠后期严重的认知损害。因此推测与神经元功能密切相关的突触可能在SAH后认知损害中发挥了更重要的作用。海马的突触可塑性是学习记忆的生物学基础,Tariq A等发现在大鼠SAH后脑血管痉挛中存在海马长时程增强(long-term potentiation,LTP)的丢失,破坏了CA3-CA1区突触间的传递,突触可塑性降低,并指出这种变化与SAH后记忆力下降有关。突触相关蛋白是突触传递、突触可塑性等功能的具体执行者,也是学习记忆过程中的重要分子之一,多种影响学习记忆功能的因素可能与突触蛋白及其磷酸化水平的改变密切相关。神经末梢突触囊泡释放神经递质是一个受到精细调控的过程,涉及到多种蛋白质间的网络状相互作用,包括蛋白质复合物的组装和构象的调节、突触囊泡的定向性运输、囊泡入坞、膜融合、递质的释放以及膜蛋白的重摄取等,这一大循环里的每一步都离不开各种相关蛋白的相互作用。Bolay H等在脑缺血性损伤中发现在缺血后的早期和长期均存在突触传递的阻断,这种突触前的缺损与选择性的synapsin-1的磷酸化水平降低有关。近几年蛋白质组学方法越来越广泛的应用于神经科学尤其是神经变性病研究中,脑血管病变的研究正相继展开。目前Honer WG等应用蛋白质组学的方法已发现多个突触蛋白在Alzheimer病中表达异常,包括synaptotagmin、synapsin、rab3a、AP2等。但SAH后突触体蛋白的表达差异未见报道。本研究拟建立SAH后迟发性脑缺血大鼠模型,并进行突触超微病理、Morris水迷宫行为学测试评价；应用免疫组化、westernblot检测synapsinⅠ及其磷酸化水平的动态变化；应用蔗糖梯度离心法提取鼠脑突触小体,采用蛋白质组学技术,比较SAH前后皮层和海马突触体蛋白的表达差异,以利探寻SAH后迟发性脑缺血认知功能损害的突触相关分子机制,并为寻找药物治疗新的靶点提供有意义的线索。本研究分三部分。第一部分蛛网膜下腔出血大鼠迟发性脑缺血模型的建立及认知功能评价目的：研究SAH二次注血大鼠模型的局部脑血流量(rCBF)、行为学测试的动态变化及突触超微病理变化,评价认知功能损害程度,探讨建立SAH认知功能障碍模型的可行性。方法：选用健康成年Wistar大鼠,采用枕大池新鲜自体动脉血二次注入法建立大鼠SAH模型,将动物随机分为正常对照组、假手术组和SAH组,各组再随机分为术后1h、1d、3d、5d、14d五个亚组。用体视显微镜及活体循环检测系统动态观察活体基底动脉管径；颅骨开窗,在立体定向仪控制下,用激光多普勒血流计动态测量动物顶叶皮层rCBF。各组大鼠2%多聚甲醛、1.25%戊二醛经心灌注固定,开颅取脑,制备超薄电镜切片,透射电镜观察照相,图像分析神经突触界面结构(突触界面曲率、突触间隙宽度、突触后质密物(PSD)厚度)。应用Morris水迷宫进行行为学测试5天,计算平均逃避潜伏期和其在平台象限游泳时间占总游泳时间的百分比作为衡量大鼠记忆功能的标准,检测各组不同时间内水迷宫学习成绩。结果：1.活体基底动脉(BA)管径观察SAH3d、5d组大鼠BA明显痉挛,管径缩窄严重,与假手术组有显著性差异(P<0.01); SAH14d组大鼠BA管径挛缩不明显。2.顶叶皮层局部脑血流量的动态变化第2次枕大池注血后SAH组rCBF迅速降低,1h下降至最低值,仅为术前值的51.8%-55.7%,ld时有较明显回升,平均rCBF为术前值的93.8%,但3d和5d时又呈明显下降趋势,14d时血流仍未恢复至对照组水平。与假手术组相比,在SAH1h、3d、5d时差异有显著性(P<0.01)。3.透射电镜观察与正常对照组大鼠相比较,SAH14d组大鼠可见海马神经元突触前膜内囊泡减少,突触前后膜模糊不清,突触间隙增宽,突触后致密物质变薄,线粒体嵴部分消失、部分粗面内质网和髓鞘裂解。SAH14d组突触活性区长度、突触间隙宽度、PSD厚度较正常对照组大鼠减少,差异有统计学意义(p<0.05)。4.Morris水迷宫测试在定位导航试验中,SAH3d组大鼠在训练第4天、SAH5d及14d组在训练第2天均出现显著的平均潜伏期延长,与假手术组相比差异具有统计学意义(p<0.05)；空间探索实验中,SAH5d及14d组大鼠的平台象限游泳时间比假手术组大鼠的平台象限游泳时间所占百分比明显降低(p<0.01)。结论：应用枕大池新鲜自体动脉血二次注入法建立大鼠SAH模型,具备迟发性脑血管痉挛缺血及认知功能损害,为探索SAH病理生理机制和药物治疗干预提供良好的动物研究模型。第二部分Synapsin I及其磷酸化水平在蛛网膜下腔出血大鼠大脑中的动态变化目的：研究SAH大鼠脑突触蛋白Synapsin I及其磷酸化水平的动态变化,探讨其在SAH后迟发性脑缺血及认知损害发生发展中的作用机制。方法：1.选用健康成年Wistar大鼠,采用枕大池二次注血法建立SAH模型,将动物随机分为假手术组和SAH组,各组再随机分为术后1h、Id、3d、5d、14d五个亚组。各组动物灌注固定断头取脑后制备脑组织石蜡切片,免疫组织化学及荧光化学方法染色,在光学显微镜及激光共聚焦显微镜下观察SynapsinⅠ及其磷酸化在脑组织中的定位分布,及其表达水平的动态变化。2.选用健康成年Wistar大鼠,采用枕大池二次注血法建立SAH模型,将动物随机分为正常对照组、假手术组、SAH后1h、1d、3d、5d、14d组。各组动物断头取脑,采用蔗糖密度梯度离心法分别提取海马和皮层神经突触小体,裂解后进行Western blot检测,分析各组SynapsinⅠ及其磷酸化表达量的差异。结果：显微镜观察显示SynapsinⅠ及磷酸化免疫沉着物主要分布在神经毡内,神经元胞核、胶质细胞及血管不被标记,大脑皮层和海马均较多表达,尤以齿状回门区为著；免疫组化和Western blot检测均显示模型组大鼠SynapsinⅠ在皮层、海马各时间点的表达量较假手术组下降,术后1d开始下降,3d达到最低(P<0.01),后逐渐恢复,至14d时基本达到假手术组水平。磷酸化SynapsinⅠ表达水平较低,亦呈动态下降趋势,但14d时与假手术组相比差异仍有统计学意义(P<0.05)。结论：1.SAH模型大鼠大脑皮层和海马SynapsinⅠ及其磷酸化含量均明显降低,以SAH后3d降低最为显著,与SAH后继发性脑血管痉挛的程度一致,表明SynapsinⅠ及其磷酸化与SAH后迟发性脑缺血的发生发展存在一定的相关性。2.SAH模型大鼠大脑皮层和海马中存在一定程度的synapsinⅠ磷酸化障碍。海马SynapsinⅠ的磷酸化抑制可能是SAH后迟发性脑缺血认知功能损害的病理生理机制之一。针对SynapsinⅠ磷酸化位点的干预处理将可能成为治疗SAH后认知功能障碍的新靶点。第三部分蛛网膜下腔出血认知损害大鼠神经突触的蛋白质组学研究目的：通过比较SAH迟发性脑缺血大鼠与假手术组大鼠皮层和海马突触体蛋白质谱,筛选和鉴定与SAH后认知功能损害密切相关的突触相关蛋白,探寻SAH后认知功能损害的新的发病机制。方法：选取Morris水迷宫行为学测试后Wistar大鼠,假手术组和SAH5d组,每组8只。采用蔗糖密度梯度离心法分别提取各组海马和皮层神经突触小体；蛋白纯化及BCA法测定蛋白浓度后,以固相pH梯度等电聚焦(IPG-IEF)为第一向,垂直平板十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)为第二向进行海马突触小体蛋白质分离；PDQUEST7.0分析电泳图谱寻找有意义的差异蛋白点：运用ultraflex TOF/TOF MS质谱鉴定,在NCBInr数据库中搜索,比对鉴定得到蛋白质信息。结果：1.成功构建出SAH大鼠脑皮层和海马突触相关蛋白2-DE图谱,图谱结果显示,大鼠脑突触相关蛋白的等电点(PI)基本都在4-7之间。分离效果较好,共找出大鼠皮层处差异蛋白点8个,海马处差异蛋白点6个。2.与假手术组比较,SAH5d组海马中表达上调的有中心体蛋白63KD,表达下调的有泛素C末端水解酶L1、伴肌动蛋白相关锚定蛋白C、GCN1、醛脱氢酶1和B肌动蛋白。3.与假手术组比较,SAH5d组大脑皮层中表达上调的有生长因子受体结合蛋白2样吞蛋白2,表达下调的有磷脂结合蛋白1、泛素C末端水解酶L1、热休克同源蛋白71、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、ATP合酶及亚型和M-phase phosphoprotein 1。结论：1.SAH认知损害大鼠与假手术组大鼠海马和皮层突触小体相关蛋白表达存在差异。2.差异蛋白根据其功能可分为细胞骨架蛋白、能量代谢酶、信号转导蛋白和分子伴侣4类,这些差异蛋白可能在神经突触可塑性、微管维持与运输、神经递质传递等方面发挥一定的作用,有利于从突触水平进一步探讨SAH后认知功能损害的发病机制。研究意义本研究建立SAH后迟发性脑缺血大鼠模型并进行Morris水迷宫认知测试评价；首次探讨synapsinⅠ磷酸化在SAH后迟发性脑缺血中的作用；首次应用突触体蛋白质组学方法初步获得了SAH迟发性脑缺血认知损害相关突触体差异蛋白14个。有利于从突触水平进一步探讨SAH后认知功能损害的发病机制和寻找新的药物作用靶点。