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研究目的与内容:本研究旨在探究CD24分子在刀豆蛋白A(Concanavalin A,Con A)诱导小鼠急性肝损伤的模型中对肝内巨噬细胞的调节作用及其可能的分子机制。实验包括以下三个方面:一、建立Con A诱导的小鼠急性肝损伤模型,观察CD24分子在小鼠急性肝损伤中的作用。二、检测CD24分子在肝脏固有免疫细胞的表达,观察CD24分子对肝内巨噬细胞的调节作用。三、分析急性肝损伤过程中肝脏巨噬细胞的来源及功能变化,探究CD24分子调节肝内巨噬细胞的分子机制。研究方法和结果:本课题实验共分三部分进行:第一部分观察CD24分子对Con A诱导小鼠急性肝损伤的作用,包括以下三个实验:1.分别以不同浓度和时间点的Con A刺激小鼠,观察小鼠解剖学上的改变,H&E染色观察小鼠肝脏损伤程度,血清学方法检测小鼠肝功能指标谷丙转氨酶(ALT)水平的变化,建立Con A诱导的小鼠急性肝损伤模型。结果表明:Con A诱导的小鼠急性肝损伤有时间和剂量依赖性,当尾静脉注射10mg/kg小鼠9h后,小鼠肝组织肿大,肝脏充血严重,且血清的ALT水平显著升高。2.观察anti-CD24中和抗体(200μg/mouse)和10mg/kg Con A联合注射组小鼠肝脏解剖学上的改变;H&E染色观察小鼠肝组织病理改变;血清学方法检测小鼠肝功能指标ALT水平的变化。结果表明:anti-CD24中和抗体导致小鼠的肝组织肿大;且出现明显的炎性细胞浸润和肝细胞坏死;小鼠的血清ALT水平显著升高。3.观察CD24-/-基因敲除小鼠注射Con A后肝脏解剖学上的改变;H&E染色观察小鼠肝组织病理改变;血清学方法检测小鼠肝功能指标ALT水平的变化。结果表明:CD24-/-基因敲除的小鼠炎症反应显著高于WT小鼠,且出现明显的炎性细胞浸润和肝细胞坏死,小鼠的血清ALT水平显著升高。第二部分观察cd24分子对小鼠肝脏巨噬细胞的调节作用,包括以下三个实验:1.流式细胞术检测小鼠肝损伤后cd24分子的表达变化及其在肝内不同免疫细胞的表达量。结果表明:cona诱导小鼠急性肝损伤后,小鼠肝组织细胞cd24分子表达显著降低。在肝脏天然免疫细胞中,cd24分子在肝内巨噬细胞的表达量最高。2.注射氯氟松(clophosome)消耗小鼠肝脏巨噬细胞,观察小鼠肝损伤后解剖学上的改变,h&e染色观察小鼠肝脏损伤程度,血清学方法检测小鼠alt水平的变化。结果表明:氯氟松消耗小鼠肝脏巨噬细胞后,小鼠的炎症反应显著下降,肝脏充血减轻,炎性细胞浸润减轻,无坏死出现,血清alt水平显著下降。且小鼠的m1型和m2型巨噬细胞均显著下降。3.流式细胞术检测不同时间点cona刺激小鼠急性肝损伤后肝内巨噬细胞亚型的改变,anti-cd24中和抗体对肝脏巨噬细胞亚型分布的影响。检测cd24-/-基因敲除小鼠和wt小鼠急性肝损伤后巨噬细胞亚型分布的改变。检测注射氯氟松消耗小鼠巨噬细胞后,巨噬细胞亚型的改变。结果表明:cona刺激3h-9h,m1型巨噬细胞的频率显著增加。anti-cd24中和抗体显著增加m1型巨噬细胞的频率,而m2型巨噬细胞的频率变化不明显。cd24-/-基因敲除小鼠的m1型巨噬细胞的频率显著高于wt小鼠,m2型巨噬细胞变化不明显。注射氯氟松后,小鼠的m1型和m2型巨噬细胞均显著下降,且cd24-/-基因敲除小鼠的m1型巨噬细胞比例高于wt鼠。第三部分探究cd24分子调节肝内巨噬细胞的分子机制,包括以下三个实验:1.realtimepcr检测不同组小鼠肝脏组织和细胞水平m1型巨噬细胞标志物的mrna表达情况,流式细胞术检测m1型巨噬细胞的来源和增殖方式。结果表明:注射cona后,小鼠肝脏组织水平和体外刺激巨噬细胞水平m1型巨噬细胞标志物的mrna表达均显著上升,m1型巨噬细胞主要为单核细胞来源,也有极小部分通过肝内的自我更新来实现。2.realtimepcr检测不同基因背景小鼠肝脏tnf-α、il-1β、il-6、il-10、il-12等炎症因子及ccr1、ccr2、ccr5等趋化因子mrna的表达情况。结果表明:cona刺激后,cd24-/-基因敲除小鼠肝脏的炎症因子mrna表达均显著高于wt小鼠。ccr2趋化因子mrna表达显著高于wt小鼠。3.Real time PCR检测注射氯氟松后,肝脏组织表达肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)的变化,肝脏巨噬细胞表达TNF-α的变化。胞内染色流式细胞术检测不同组小鼠肝脏M1型巨噬细胞分泌TNF-α的变化,流式细胞术检测TNF-α诱导的肝细胞的凋亡率。结果表明:注射氯氟松后,小鼠肝脏组织的TNF-αmRNA表达显著下降。Anti-CD24中和抗体和CD24-/-基因敲除小鼠的M1型巨噬细胞细胞分泌的TNF-α均显著高于WT对照组小鼠。联合刺激组小鼠和CD24-/-基因敲除小鼠的肝细胞早期和晚期凋亡率均显著高于WT对照组小鼠。结论:1.Con A诱导的小鼠急性肝损伤具有时间和剂量依赖性,CD24分子可以保护Con A诱导的小鼠急性肝损伤。2.CD24分子对肝内巨噬细胞亚型具有调节作用,通过抑制M1型巨噬细胞的表达来保护Con A诱导的小鼠急性肝损伤。3.肝内M1亚型巨噬细胞主要来源于单核细胞,极少量来源于肝内的自我增殖和更新,CD24分子可以降低单核细胞来源的M1型巨噬细胞。4.CD24分子通过抑制M1型巨噬细胞分泌TNF-α,进而抑制肝细胞的凋亡,来保护Con A诱导的小鼠急性肝损伤。