克雷伯氏肺炎杆菌(Klebsiella pneumoniae)作为重要的工业生产菌,通过基因工程手段对其代谢途径进行改造已成为趋势,例如副产物合成途径的减弱或消除;或是目标产物合成途径的强化等。因此,本文旨在为其基因工程改造提供更多技术手段和基础研究数据。本文在Red重组系统的基础上设计了一套将目的基因整合于基因组的方法。通过三步PCR法成功地扩增出由4个片段构成的打靶片段,运用该打靶片段在敲除副产物2,3-丁二醇合成基因(budA+budB)的同时将合成1,3-丙二醇氧化还原酶的dhaT基因(含bud启动子)整合到基因组,构建出敲除乳酸、2,3-丁二醇、整合表达dhaT基因的工程菌:KG3-2。通过测定比较发酵培养过程中NADH/NAD+变化验证了dhaT基因成功表达;但整合后为单拷贝,目标产物表达量较少,其恢复菌体内氧化还原平衡的能力不如含表达载体pETbud::dhaT的菌株KG3-1,这可通过使用更强的其他启动子来克服。因此,本文通过laacZ报告基因进一步系统比较了一组表达效率不同的启动子(Pbud、PT5、Ptac)在不同碳源培养条件下的真实表达水平,以满足克雷伯氏肺炎杆菌中不同表达水平的需要。结果表明,尽管启动子PT5和Ptac是专为大肠杆菌设计的,但在克雷伯氏肺炎杆菌中同样有效。LB培养基中，Ptac对于lacZ的基础表达达到了 396.5 U/mg,是PT5的9.5倍,这表明Ptac在克雷伯氏肺炎杆菌中在作为诱导型强启动子的同时还能作为有效的组成型启动子。在不同碳源培养基中,新构建的内源性启动子Pbud表现为稳定的弱启动子。根据我们的结果,在克雷伯氏肺炎杆菌中结合使用Pbud和Ptac启动子可满足不同水平(数量级相差1000倍)的基因表达需求。