目的:肾间质纤维化(renal interstitial fibrosis RIF)是指由多种原因引起的细胞外基质成分(ECM)在肾间质内过度沉积,是各种慢性肾脏疾病进行性发展的共同病理基础。目前其发病机制尚未完全阐明。现有研究证明,氧化应激损伤在肾间质纤维化发病过程中起重要作用,抗氧化能有效延缓肾间质纤维化进程。近些年人们研究发现Keap1-Nrf2-ARE信号通路介导并激活多种抗氧化基因和II相解毒酶基因的转录,从而减轻ROS和亲电子物质引起的细胞损伤,这一信号通路在机体抗氧化应激、抗肿瘤、抗衰老、保护缺血再灌注组织等方面中发挥重要作用。然而Keap1-Nrf2-ARE信号通路在肾间质纤维化中的作用尚未见报道。丁苯肽是一种抗氧化应激药物,广泛用于缺血性脑损伤的治疗,但目前关于丁苯酞在梗阻性肾病小鼠模型中抗氧化应激作用的研究在国内尚无报道。本课题通过建立单侧输尿管结扎致梗阻性肾病小鼠模型,观察丁苯酞对梗阻性肾病小鼠肾间质纤维化的保护作用,并通过与贝那普利进行对照观察其疗效,以进一步探讨其作用机理。方法:清洁级CD-1小鼠72只(雄性),将小鼠随机分为4组:假手术组(Sham)、模型组(UUO)、治疗组(NBP)、对照组(ACEI)。假手术组、模型组均给予等量生理盐水灌胃。治疗组、对照组分别给予丁苯酞180mg/kg/d、贝那普利5mg/kg/d灌胃。实验期间动物自由摄食水,每天注意观察小鼠的一般状况,有无饮食及活动异常。各组分别于术后第3、7、14天处死6只小鼠,取梗阻侧肾组织。用0.9%盐水充分清洗后放入10%中性福尔马林固定,待做病理切片、免疫组化染色;把另取部分肾组织放入液氮使组织迅速冷冻,防止蛋白降解,-70℃保存待测western blot。再另剩余肾组织用DEPC水处理使RNA酶灭活后移入液氮使组织迅速冷冻,最后-70℃超低温保存待做RT-PCR实验;所有实验数据均采用SPSS16.0统计软件进行统计学分析,P<0.05认为是组间有统计学差异。1小鼠肾脏组织病理改变1.1肉眼:解剖后用肉眼观察假手术组肾脏颜色及大小正常,其余各组小鼠肾脏均有不同程度增大,其中尤以模型组肾脏增大最为明显,治疗组及对照组肾脏外观大体变化均较模型组轻。1.2光镜:1.2.1 HE染色观察模型组小鼠肾小管上皮细胞有脱落、空泡样变性,其间质有炎细胞浸润,呈弥漫性,偶有间质纤维化,观察肾小管有扩张、萎缩、塌陷,其基底膜结构不完整,随着梗阻时间的延长,间质、肾小管的结构基本消失;而肾小球病变程度不一。假手术组小鼠肾组织结构正常,无异常改变,亦无纤维组织增生。治疗组与模型组比较有不同程度的减轻。其与对照组相比,对照组病变程度介于治疗组、模型组之间。1.2.2 Masson染色模型组Masson染色显示肾间质较前增宽,间质组织、细胞较前增多,并存在肾小管广泛扩张,肾间质、肾小球内有大量胶原纤维,并且可见胶原纤维逐渐向肾组织周围延伸,并且相互交织成“网状”。假手术组显示肾组织相对完整,肾细胞排列比较规则,结构尚清晰,仅个别有少量胶原纤维。治疗组与模型组比较有不同程度的减轻。其与对照组相比,对照组病变程度介于治疗组、模型组之间。2免疫组化结果Nrf2在正常肾组织中仅散在表达于肾小管上皮细胞中,从图像分析结果可以看出,3天时治疗组小鼠肾组织Nrf2呈阳性,并且随着输尿管梗阻时间的延长,Nrf2表达逐渐增强,至7天、14天时与模型组比较,有显著性差异(P<0.05),分别为7天治疗组与模型组比较(0.1973±0.0294)vs(0.1579±0.0076)、14天治疗组与模型组比较(0.2722±0.0338)vs(0.1152±0.0128);且丁苯肽组Nrf2表达(0.2722±0.0338)强于贝那普利组(0.2104±0.0358),二者统计学数据具有显著意义(P<0.05)。γ-GCS主要在肾小球和皮质肾小管上皮细胞内表达,在髓质肾小管仅有少量分布。从图片及图像分析结果可以看出,3天时治疗组小鼠肾组织γ-GCS呈阳性,并且随着输尿管梗阻时间的延长,γ-GCS表达逐渐增强,至7天、14天时与模型组比较表达明显增加(P<0.05);7天时治疗组与模结果:型组比较(0.1487±0.0207)vs(0.1035±0.0021),14天时治疗组与模型组比较为(0.3009±0.0366)vs(0.0729±0.0039),且丁苯肽组γ-GCS表达强于贝那普利组。分别为(0.3009±0.0366)vs(0.2255±0.0436),两组间比较有统计学差异(P<0.05)。I型胶原蛋白正常情况下在肾小管上皮细胞、间质细胞及肾小球系膜细胞胞浆中有少量表达,在胞浆内出现浅棕色颗粒呈弱阳性表达。从图片及图像分析结果可看出,I型胶原蛋白在假手术组有极少量表达。3天后模型组小鼠较治疗组(0.1089±0.0055)vs(0.1527±0.0339)明显升高(P<0.05),并且以后随着梗阻时间的延长,病变进一步加重,I型胶原蛋白表达逐渐增多,至14天时表达达到高峰。治疗组小鼠在各时间点较模型组表达显著减少(P<0.05)。3 RT-PCR结果RT-PCR检测Nrf-2 m RNA结果显示:与同期假手术组相比,术后3、7、14天模型组小鼠肾组织中Nrf-2m RNA表达均增加,给予丁苯肽干预后,在第7、14天治疗组与模型组相比,小鼠中Nrf-2表达均增加(P<0.05),7天时治疗组与模型组比较(0.4917±0.0129)vs(0.3554±0.0274)(P<0.05),14天时治疗组与模型组比较为(0.5205±0.0165)vs(0.3648±0.0101)(P<0.05)。丁苯肽组Nrf-2表达强于贝那普利组,于第14天分别为(0.5205±0.0165)vs(0.4246±0.0097),二者统计学数据具有显著意义(P<0.05)。RT-PCR检测γ-GCSm RNA结果显示:与同期假手术组相比,术后3、7、14天模型组小鼠肾组织中γ-GCSm RNA表达均增加,给予丁苯肽干预后,与同期模型组相比,治疗组小鼠中γ-GCSm RNA表达均增加。7天时治疗组与模型组比较(0.5731±0.0205)vs(0.4519±0.0149)(P<0.05),14天时治疗组与模型组比较为(0.7186±0.0342)vs(0.4855±0.0117)(P<0.05)。丁苯肽组γ-GCS表达强于贝那普利组,于第14天分别为(0.5205±0.0165)vs(0.4246±0.0097),二者统计学数据具有显著意义(P<0.05)。RT-PCR检测结果显示:与同期假手术组相比,术后3、7、14天模型组小鼠肾组织中I型胶原蛋白m RNA表达均增多(P<0.05),给予丁苯肽干预后,至7天、14天时与模型组比较表达减少,两组间比较有统计学差异(P<0.05)。4 western结果Western实验Nrf-2蛋白的表达:与同期假手术组相比,术后7、14天模型组Nrf-2蛋白表达均增加(P<0.05),7天时治疗组与模型组比较(0.6143±0.0118)vs(0.3522±0.0065),14天时治疗组与模型组比较为(0.7027±0.0218)vs(0.3356±0.0030)。各组间均有统计学差异(P<0.05)。且14天较7天更为显著。丁苯肽组Nrf-2表达强于贝那普利组,于第7天分别为(0.6143±0.0118)vs(0.4450±0.0107),于第14天分别为(0.7027±0.0218)vs(0.4531±0.0054),二者统计学数据具有显著意义(P<0.05)。western实验γ-GCS蛋白的表达:与同期假手术组相比,术后7、14天模型组γ-GCS蛋白表达均增加(P<0.05),7天时治疗组与模型组比较(0.6843±0.0147)vs(0.3268±0.0099),14天时治疗组与模型组比较为(1.0053±0.0113)vs(0.4589±0.0145)。各组间均有统计学差异(P<0.05)。且14天较7天更为显著。丁苯肽组γ-GCS表达强于贝那普利组,于第7天分别为(0.6843±0.0147)vs(0.3863±0.0097),于第14天分别为(1.0053±0.0113)vs(0.7232±0.0063),二者统计学数据具有显著意义(P<0.05)。I型胶原蛋白western结果显示:与同期假手术组相比,术后7、14天模型组小鼠肾组织中I型胶原蛋白表达均增多(P<0.05),给予丁苯肽干预后,至7天、14天时与模型组比较表达减少;7天时治疗组与模型组比较(0.5649±0.0064)vs(0.9681±0.0109),14天时治疗组与模型组比较为(0.4392±0.0077)vs(1.1199±0.0902),两组间比较有统计学差异(P<0.05)。结论:1在肾间质纤维化的发生、进展过程中Keap1-Nrf2-ARE信号通路起到了保护作用,并进一步证实Nrf2、r-GCS能延缓肾间质纤维化的进展。2丁苯肽有抗肾间质纤维化作用,机理可能与激活Keap1-Nrf2-ARE信号通路,提高肾间质中Nrf-2、抗氧化酶r-GCS活性水平有关。3短期观察丁苯肽的肾保护作用优于贝那普利。