目的:溃疡性结肠炎（Ulcerative colitis,UC）是一种累及结肠的慢性非特异性炎症疾病。近年来,中国人群UC患病率和发病率在不断升高。目前临床上治疗药物包括5-氨基水杨酸,皮质类固醇,免疫抑制剂和生物制剂等。然而这些治疗药物存在显著的副作用,仍有部分患者对其不敏感,导致病情进一步恶化,最终不得不进行手术切除。为提高UC患者的生存质量,急需开发更加安全有效的治疗药物。藏药绿萝花是天南星科希林芋属植物滇结香（Edgeworthia gardneri）的干燥花蕾,民间常用绿萝花治疗糖尿病、冠心病、高血压和各种血管炎症疾病。绿萝花中含有双香豆素类、黄酮类、脂肪酸和三萜等多种成分。其中,含量最高的黄酮类化合物银椴苷（tiliroside）被证实具有良好的抗炎、抗氧化和促进伤口愈合的作用。本课题通过建立小鼠结肠炎模型,研究tiliroside对结肠炎的抑制作用和机制。方法:1、选择6-8周龄的雌性C57BL/6小鼠和雄性BALB/c小鼠,构建葡聚糖硫酸钠（dextran sulfate sodium,DSS）及三硝基苯磺酸（TNBS）诱导的结肠炎模型。给药组小鼠自造模当天起每天灌胃给予5-氨基水杨酸（5-aminosalicylic acid,5-ASA）或不同剂量的tiliroside（12.5,25.0,50.0 mg/kg）。此外,通过腹腔注射氯磷酸脂质体（clodronate liposomes）和对照脂质体,清除小鼠体内巨噬细胞,复制DSS诱导的小鼠结肠炎模型。记录各组小鼠存活率,通过观察体重、便血及腹泻情况,计算疾病活动指数（disease activity index,DAI）,测量小鼠结肠长度,检测结肠组织髓过氧化物酶（myeloperoxidase,MPO）活力,H&E染色法检测结肠组织病理变化;2、采用免疫荧光法检测结肠组织巨噬细胞的极化表型,采用qPCR法测定小鼠结肠组织M1型巨噬细胞标记物（Tnf-α、Il-1β、Inos）、M2型巨噬细胞标记物（Arg1、Chil3、Cd206）及肠道屏障相关蛋白（Cldn7、Ocln、Cdh1）的mRNA水平;采用流式细胞术检测了结肠黏膜固有层中CD4+、CD8+T细胞和CD19+B细胞的比例。3、采用MTT法检测tiliroside对小鼠骨髓来源巨噬细胞活力的影响,以LPS和IFNγ诱导M1型巨噬细胞、IL-4诱导M2型巨噬细胞,采用qPCR法检测tiliroside对巨噬细胞极化标志物及LPS和IFN受体（Tlr4、Cd14和Ifngr）的影响。4、采用葡萄糖类似物2-NBDG检测银椴苷对糖摄取的影响,采用qPCR法检测银椴苷对M1型巨噬细胞糖酵解相关酶mRNA表达的影响,采用乳酸试剂盒检测乳酸变化,采用糖酵解速率测定试剂盒检测银椴苷对巨噬细胞的细胞外酸化率的影响。5、采用qPCR和western blotting法检测tiliroside对M1型巨噬细胞中缺氧诱导因子-1α的表达,采用免疫沉淀法检测tiliroside对HIF-1α泛素化的影响。结果:1、Tiliroside能显著缓解DSS诱导的结肠炎小鼠的体重降低,下调DAI评分,抑制结肠长度缩短,减少结肠组织的MPO活力,改善结肠组织病理损伤。类似地,tiliroside可以显著降低TNBS诱导的结肠炎小鼠的死亡率,下调DAI评分,抑制结肠的缩短,减少结肠组织的MPO活力并改善结肠组织的病理损伤,通过两种小鼠结肠炎模型,证实tilirosdie具有良好的抗结肠炎作用。2、结肠组织的免疫荧光结果表明,tiliroside下调结肠组织黏膜固有层中M1（CD68+iNOS+）并上调M2型（CD68+CD206+）巨噬细胞比例。qPCR结果表明,tiliroside显著下调结肠组织中M1（Tnf-α、Il-1β、Inos）并上调M2型巨噬细胞的标记物（Arg1、Chil3、Cd206）的mRNA表达;Tiliroside（12.5,25.0,50.0mg/kg）对肠屏障功能相关蛋白（Cldn7、Ocln、Cdh1）和小鼠结肠组织黏膜固有层中CD4+、CD8+T细胞和CD19+B细胞的比例没有明显的作用,表明了tiliroside药效的发挥不依赖于上皮屏障功能、T细胞和B细胞。此外,对比巨噬细胞清除组与巨噬细胞清除+tiliroside联用组的DAI评分,结肠MPO活力,结肠长度的缩短以及结肠组织的病理学,确定了tiliroside抗结肠炎作用的发挥依赖于巨噬细胞。3、MTT结果表明tiliroside（5,10,20,40,80μM）对巨噬细胞没有毒性作用,tiliroside（10,20,40μM）显著抑制了M1型巨噬细胞标记物（Tnf-α、Il-1β、Inos）的表达,而对M2型巨噬细胞标记物（Arg1、Chil3、Cd206）没有显著影响。4、在M1型巨噬细胞中,tilirosde（10,20,40μM）显著抑制了葡萄糖摄取、糖酵解相关酶（Glut1、Eno1、Pkm、Pdk1、Aldolase、Ldha、Pgam、Pfk、Gapdh）的mRNA水平,乳酸的生成及细胞外酸化率。5、通过western blotting和qPCR考察tiliroside对缺氧诱导因子1α（hypoxia inducible factor 1α,HIF-1α）的影响。实验结果表明,tiliroside下调了HIF-1α的蛋白水平,但对其转录水平无影响。进一步使用蛋白合成抑制剂CHX与tiliroside共同作用,证明了tiliroside具有促进HIF-1α蛋白降解的作用。然后,选用了蛋白酶体抑制剂和溶酶体抑制剂与tiliroside联用,考察其作用的依赖性。结果表明,tiliroside主要通过蛋白酶体途径实现对HIF-1α蛋白的调控。最后,采用免疫共沉淀法,检测tiliroside对HIF-1α泛素化作用。结果显示,tiliroside促进了HIF-1α蛋白的泛素化积累。结论:1、Tiliroside通过调节结肠组织中的M1/M2型巨噬细胞平衡抑制结肠炎的发生发展。2、Tiliroside可以促进HIF-1α泛素-蛋白酶体途径的降解,从而抑制糖酵解过程,阻止M1型巨噬细胞的极化。