论文部分内容阅读
背景及目的：充血性心衰（Congestive heart failure，CHF）是常见的临床综合征，严重威胁着患者的身心健康，目前对CHF的防治仍然是临床与基础心血管病研究的重要课题。临床研究证实心肌肥大是心衰发生与发展重要的病理基础，是心功能由代偿向失代偿演变的关键步骤，也是心血管各种并发症发病率与死亡率的独立危险因素。因此，阐明心肌肥大的发生机制无疑对心衰的防治具有重要的意义。 心肌肥大是指心肌在外界因素作用后出现的一系列组织细胞形态学的适应性变化，主要包括心肌细胞肥大、成纤维细胞增生和间质纤维化。心肌肥大最本质的特征是核内基因表达的改变，不同的刺激因素诱发的基因表达模式不尽相同，这主要取决于所启动的信号传导通路。有关心肌细胞肥大时细胞信号传导路径，细胞内信号物质如何调控细胞肥大和增生过程等，目前还不十分清楚。 自二十世纪六十年代首次报道血管紧张素Ⅱ（AngiotensinⅡ，AngⅡ）对心脏的直接作用后，八十年代利用先进的分子生物学手段发现了包括AngⅡ在内的各种肾素-血管紧张素系统（RAS）成分在心脏局部的存在，并证实局部RAS的激活与心肌肥大的发生密切相关，RAS中的主要活性物质是AngⅡ，其生物学作用是通过位于组织细胞上的特异性受体介导的。根据受体不同的药理学特性，AngⅡ的受体分为AT1受体（AT1-R）和AT2受体（AT2-R）两种亚型。放射性配体研究显示在心肌 解放军总医院 军医进修学院 博士研究生论文 细胞两种受体分布比例大致相同，但己知的Angll的大多数效应是由 AT；－R介导的，而对AT广R的功能了解相对较少。Angll受体的两种亚 型均是G蛋白偶联受体家族的成员。Angll通过G蛋白偶联受体激活 相应的G蛋白进而可激活多种胞浆内信号转导分于，与细胞增殖密切 相关的细胞外信号调节激酶（EXtf8CCllllsf Sigfl。IRCglll。ted Klfl＆SC，之ERK）就是其中的一种信号物质。近年来丝裂素活化蛋白激酶信号系 统（Mltogen－activated Protein Kinase System，MAPKs）己被发现参与 了多种细胞的生长、增殖及分化过程。该通路的核心是由3种蛋白激 酶构成的蛋白撤酶反应链，即MAPKKK－MAPKK－MAPK或 RafMEKIRK卜 由G蛋白介导的心肌细胞肥大效应主要是通过该信 号级联实现的。ERK是丝。苏氨酸蛋白激酶，是卜述激酶反应链中的 终级信号物质。研究发现，与上游的Raf及MEK所不同的是，ERK 可发生核转位（nuclear translocation），是将多种细胞外信号向核传导、 影响基因调控的共同通路或汇聚点，并且许多ERK的核作用底物是转 录因子，因而对ERK核易位机制的研究则显得十分重要。本研究以原 代培养的心肌细胞为研究对象，用Angll作用心肌细胞，从受体水平 和 ERK水平进行干预来观察心肌细胞活力、原癌基因表达变化，探讨 MAPK j＄酶系统终极信号物质ERK的跨核转运过程与机制，期望寻找 到能有效干预ERK跨核转运的措施，从而更加深入地认识心肌细胞肥 大的发生机理，为心肌肥大及其它心血管疾病的有效防治提供实验依－据与理论指导。 方法：以原代培养的新生SD大鼠心肌细胞为研究对象，将主要 分为以下几部分进行研究：l、对 Angll受体和 MAPK信号不同水平 进行干预，用MTT方法检测Angll作用心肌细胞活力的变化情况，即 观察从ATI1和 ATZl受体到MEK信号干预对心肌细胞活力影响如 何。2、兔疫细胞化学方法观察ERK入核情况并进一步采用RT－PCR 7 解放军总医院 军医进修学院 博士研究生论文半定量方法分析 c－fos mRNA表达 3、ERK入核机制研究，采用 Westernhi川 半定量分析蛋白酶抑制剂和蛋白合成抑制剂作用心肌细胞后，胞核中磷酸化和非磷酸化ERK蛋白表达，同时用细胞兔疫荧光化学法并惜助激光共聚焦显微镜观察ERK核内外分布变化。 结果：1、Angll刺激心肌细胞 12h时，在 10“’～10”’mol几浓度范围内，呈浓度依赖性促心肌细胞活力增加的变化，以Angll浓度为10‘mol几时心肌细胞 MTT产物的 OD值最大；10‘mol／L Angll刺激心肌细胞36小时，心肌细胞由良好的贴壁伸展状态发展为成片脱落直至部分细胞死亡，细胞悬浮而且贴壁细胞数量变得较为稀少，显示细胞贴壁能力下降。 2、ATIKa抗剂Vals盯m有桔抗Allgll提高心肌细胞活力的作用；AT广工桔抗剂CGP42llZA对Angll的作用与Angll组比较无明显差异；MEK阻断剂PD098059对Angll的作用有明显的抑制效应。 3、