巨桉抗寒相关基因EgrCT和EgrDREB2A的胁迫响应表达分析

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非生物逆境是影响植物生长和发育的主要因子。在低温、高温、干旱、土壤盐渍化等因子影响下,植物生理代谢失衡,细胞结构遭到破坏,引起植株生长发育障碍甚至死亡。为了应对不利非逆境因子对植物生长发育的影响,在长期进化过程中,植株逐渐形成了一系列的耐受和抵抗非生物逆境胁迫影响的机制。其中,大量的基因参与了植物对逆境胁迫的响应和调控。对这些基因的研究有利于揭示植物抵抗逆境胁迫的分子机制,进而利用遗传工程手段和分子遗传育种手段为改良经济植物的抗逆性提供理论基础和实验依据。本研究通过4℃低温条件下mRNA SSH(0.5,2,6,12,24,48h)差别显示文库中的构建,从中筛选出两个低温诱导表达基因序列,根据桉树基因文库数据对这两个序列的注释分别将其命名为EgrCT(Eucalyptus grandis Cold Tolerance)和EgrDREB2A。对这两个基因序列的生物信息学分析结果表明EgrDREB2A基因编码的蛋白属于AP2/EREBP转录因子家族的DREB2A类。而EgrCT基因序列没有明确功能的注释。我们还分别构建了EgrCT::sGFP和EgrDREB2A::sGFP融合表达载体,用基因枪法轰击洋葱表皮进行瞬时表达,对这两个基因的蛋白表达进行了亚细胞定位,结果表明EgrCT和EgrDREB2A蛋白均定位于细胞核中。EgrCT和EgrDREB2A基因不同低温(0,2,4,6,8℃)以及4℃低温不同处理时间(0.5,2,6,12,24,48h)条件下的qRT-PCR结果分析表明:它们在低温下都被诱导表达,EgrCT在2℃时表达量最高,在4℃不同时间处理下,EgrCT的表达量随时间变动而呈现波动;而EgrDREB2A同样受不同低温(0,2,4,6,8℃)的诱导表达。且4℃下EgrDREB2A的表达量在48h时表达量达到最高。在盐胁迫下,EgrCT基因的表达受到明显抑制,EgrDREB2A基因的表达在盐胁迫下是被诱导表达的。在ABA胁迫下,EgrCT基因在2h有瞬时表达,但在随后时间表达受到抑制,EgrDREB2A基因的表达呈先升后降的趋势。在昼夜节奏变化对基因表达影响的实验中,发现24h内EgrCT和EgrDREB2A基因的表达都是呈先升后降的趋势,表明两个基因的表达受昼夜节奏变化的影响。另外,我们还对EgrCT和EgrDREB2A进行了组织器官特异性的的表达分析,结果表明EgrCT和EgrDREB2A基因在根、茎、叶中都有表达,但在叶中表达量较高。由于EgrCT是一个未知功能的基因,为了进一步了解其核内的可能功能,通过构建PGBKT7::EgrCT载体,利用酵母系统,分析了其体外转录活性,但结果表明该基因表达产物不具备体外转录激活特性。利用农杆菌侵染的方式将EgrCT和EgrDREB2A基因转入拟南芥中,目前根据对T1代植株的PCR鉴定,分别获得10株和9株阳性植株。利用基因超表达方式研究基因功能是一种常用的基因功能研究方法。
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