方形网纹溞和大型溞生殖转换机制的研究

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枝角类(Daphnia)是一类小型的浮游甲壳动物,其生殖方式有孤雌生殖和两性生殖两种类型。通常在外界条件比较适宜时行孤雌生殖;在不良环境条件下行两性生殖产生休眠卵以渡过逆境。对于枝角类生殖转换的研究,多集中在环境诱导因子的描述及化学物质的生殖毒性等方面,鲜有关注其内在分子机制的报道。本研究首先从方形网纹溞(Ceriodaphnia quadrangula)的发育入手,检测并筛选影响枝角类生殖模式的环境因子;之后以大型溞(Daphnia magna)为研究对象,对重要诱导因子——种群密度进行定性分析,对高密度大型溞养殖水中的化学成分进行检测;建立了激素(苯氧威)高效诱导大型溞生殖转换的方法,并对诱导过程中的大型溞进行了转录组测序分析;最后对转录组中差异表达的基因进行分析鉴定,对筛选到的部分潜在相关基因进行功能验证。本研究取得的主要结果如下:1、以方形网纹溞为实验材料,重点分析了温度、光照周期、种群密度对其生殖转换发生的影响。实验发现这些因素均可影响方形网纹溞孤雌生殖与两性生殖间的生殖方式转换,其中种群密度是最重要的影响因素。2、以大型溞为实验材料,验证了高密度饲养是高效的两性生殖方式诱导因子;采用高效液相色谱(HPLC)与气质联用(GCMS)等方法,从高密度大型溞饲养水中鉴定出了一种保幼激素类似物——苯氧威;大于2μg/L的苯氧威处理大型溞孤雌生殖的个体能诱导其所产子代几乎全部为雄性。3、用1μg/L的苯氧威处理孵育囊怀有囊胚期夏卵的壮年雌溞,分别在激素刺激后的6 h、24 h和36 h取样,利用Illumina HiSeqTM 2500平台进行转录组测定,得到195869条unigenes,平均长度为793 bp。通过Blastx算法比对到Nr、Nt、KO、SwissProt、PFAM、GO和KOG等7个公共数据库中,得到注释的基因共有139042条,占转录组总unigenes的66.85%。对unigenes的差异表达图谱进行分析,对差异表达基因的种类和数量进行系统地阐述,并完成了部分编码蛋白的功能及代谢通路的初步研究。4、对大型溞转录组中差异表达基因进行分析、筛选和重新注释,从激素处理6 h后的大型溞差异表达基因中鉴定出含有DM结构域的Doublesex(Dsx)、含有HLH结构域的Daughterless(Dal)和含有JmjC结构域的组蛋白去甲基化酶等可能与生物体生殖发育和性别分化相关的基因。经过初步分析与推断,枝角类大型溞的性别决定应该在胚胎发育的初期就已经确定了。5、对筛选出来的3条基因进行基因功能的验证。利用RNAi技术有效敲低了DmDsx、DmDal和DmJmjC基因在大型溞体内的表达,此时用苯氧威处理会不同程度地降低其子代雄性个体的比例,说明这3个基因参与了大型溞的生殖发育和性别决定等过程。
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