研究背景与目的:脑卒中的是目前我国第一大死亡原因,其中出血性脑卒中约占全部脑卒中的15%,其在我国发病率远高于欧美发达国家,具有高发病率、高死亡率和高致残率的特点。脑出血引起的损害主要包括血肿的机械压迫作用和血肿释放的物质引起的继发性损伤,血肿机械压迫作用与血肿体积、血肿部位相关,在内科治疗中难以干预,且多项临床研究显示,血肿清除并不能改善患者的预后,减轻患者的死亡率;继发性损伤主要来源于脑出血后血液成分引起的炎症反应、氧化应激等,研究表明,减轻脑出血后的继发性损伤可以显著减轻动物的神经功能缺损及死亡率。因此对继发性损伤的干预是目前脑出血研究的主要方向。越来越多的证据证明,基因的转录后调控参与卒中的发生发展。Dykstra-Aiello C等人通过收集急性期脑出血与脑梗死患者及正常人的外周血标本,通过RNA高通量测序（RNA high-throughput sequencing,RNA-seq）发现,脑出血及脑梗死患者的外周血RNA发生了明显的选择性可变剪接（Alternative splicing,AS）,这些有差异的转录组和AS主要涉及在炎症反应,氧化应激,细胞因子等通路,提示基因的转录后调控可能与脑出血后继发性损伤有密切的关系。基因的转录后调控是指基因转录为RNA后发生的各种变化,包括AS,选择性多聚腺苷酸化,基因的差异表达,RNA的甲基化等等。但无论那种类型的转录后调控,都离不开RNA结合蛋白,因为RNA结合蛋白参与转录后调控全过程。既往的研究表明,通过RNA结合蛋白来调节基因的转录后调控可以改变疾病的发展。这些证据提示我们,通过RNA结合蛋白调节脑出血的转录后调控,从而减轻脑出血的继发性损伤具有可行性。过氧化物还原酶1（Peroxiredoxin 1,Prdx1）是过氧化物还原酶家族的一个,主要参与体内的氧化还原反应,通过还原体内被氧化的蛋白、氧自由基等发挥保护作用。Prdx1的功能多样,参与肿瘤侵袭、转移;在炎症反应和细胞凋亡中也发挥很重要的作用。除此之外,Prdx1也是一个RNA结合蛋白。但是作为RNA结合蛋白,Prdx1如何参与转录后调控尚不清楚。且既往研究表明脑出血后Prdx1的表达明显增高,增高的Prdx1如何参与脑出血的继发性损伤也不清楚。为此,本研究通过注射腺相关病毒过表达Prdx1并构建脑出血模型,结合体外RIP-seq及RNA-seq等,探讨Prdx1对脑出血继发性损伤的作用及机制。方法:第一部分Prdx1在脑出血后继发性损伤中的作用脑出血后血肿周围组织Prdx1的表达变化及细胞定位1.检测脑出血后血肿周围组织的Prdx1表达变化建立假手术组模型及脑出血模型,于脑出血后3d处死大鼠,取出血肿周围组织提取RNA及蛋白质。采用qRT-PCR方法检测脑出血后Prdx1 mRNA水平的表达变化,采用Western-blot方法检测脑出血后Prdx1蛋白水平的表达变化。于脑出血后3d处死大鼠,对脑组织进行切片,采用免疫组化染色检测血肿周围组织与假手术组相同区域中Prdx1阳性细胞的数量变化。2.检测脑出血后血肿周围纹状体区的Prdx1的细胞定位采用免疫荧光方法,检测血肿周围纹状体区与假手术组相同区域,Prdx1在神经元,星形胶质细胞及小胶质细胞中的细胞定位。Prdx1对脑出血后继发性损伤的作用1.通过纹状体注射过表达Prdx1或者空载体的腺相关病毒,建立Prdx1过表达大鼠模型,3周后再建立脑出血模型,对比sham组,WT组,Prdx1过表达组和Vector组的大鼠死亡率,统计Prdx1对脑出血死亡率的影响。2.于脑出血后3d处死4组SD大鼠,取脑组织,分别称量各组出血侧和对侧脑组织的湿重并记录,将脑组织于100℃烤箱中过夜,统计干重,计算各组脑含水量（Brainwater content,BWC）。3.在脑出血后3d,利用改良神经功能评分（modified Neurological Severity Score,mNSS）评价每组SD大鼠的神经功能并进行统计。4.在脑出血后3d处死4组SD大鼠,取脑组织,冠状切为1毫米的组织切片,采用Image-Pro Plus 5.0计算各组SD大鼠血肿体积。5.通过对4组SD大鼠血肿周围组织进行尼氏染色及Fluoro-Jade B染色比较各组大鼠血肿周围组织神经细胞变性情况。6.取4组SD大鼠血肿周围组织,提取RNA及蛋白质,通过Western blot检测凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax的表达变化,通过qRT-PCR检测4组SD大鼠血肿周围组织炎症因子白细胞介素-6（Interleukin-6,IL-6）,白细胞介素-10（Interleukin-10,IL-10）及肿瘤坏死因子-α（Tumor necrosis factor-α,TNF-α）的表达变化。第二部分Prdx1调控脑出血继发性损伤中的机制1.筛选RNA结合蛋白Prdx1在HeLa细胞中结合的RNA利用HeLa细胞,通过RNA免疫共沉淀结合高通量测序技术（RNAImmunoprecipitation and high-throughput sequencing,RIP-seq）筛选出Prdx1结合的所有RNA,并进行GO富集分析。2.筛选Prdx1引起的差异表达基因在HeLa细胞中转染过表达Prdx1的质粒,建立Prdx1过表达的He La细胞系,对正常的Hela细胞系和Prdx1过表达的Hela细胞系进行RNA高通量测序,筛选出Prdx1过表达后引起的差异表达基因,对这些差异基因进行GO富集分析。3.通过体内及体外模型对Prdx1的作用机制进行验证利用大鼠脑提取原代星形胶质细胞,利用RNA免疫共沉淀结合qRT-PCR技术,对RIP-seq数据进行验证,提取Prdx1过表达组,Vector组,WT和sham组的脑组织RNA,利用qRT-PCR技术验证RNA-seq数据。结果:第一部分1.与假手术组相比,脑出血3天后,血肿周围组织的Prdx1 mRNA水平（F=8.421,t=-19.474,**P<0.01 vs sham,n=3）及蛋白水平（F=2.014,t=-3.432,**P<0.01 vs sham,n=3）均明显升高,且血肿周围组织中的Prdx1阳性细胞数量较假手术组也显著增多（比例尺,100μm,F=1.225,t=-7.288,**P<0.01 vs sham,n=3）。2.免疫荧光染色显示,脑出血后,血肿周围组织纹状体区中升高的Prdx1主要表达在星形胶质细胞和小胶质细胞中,而不表达于神经元中(比例尺,25μm,F=10.964,t=-11.790,^##P<0.01 vs Prdx1/NeuN.F=12.000,t=-60.228,**P<0.01 vs Prdx1/NeuN,n=3)。3.在大鼠脑组织中过表达Prdx1后,可以显著降低脑出血后的死亡率（χ2=14.310,df=3,*P<0.05 vs Vector,^#P<0.05 vs WT,n=20）,减轻神经功能缺损计(df=3,F=75.196,**P<0.01 versus Vector,^##P<0.01 versus WT,n=5),抑制脑水肿(df=3,F=9.324,*P<0.05 vs Vector,^##P<0.01 vs WT,n=6),减小血肿体积（df=3,F=151.467,*P<0.05 vs Vector,^#P<0.05 vs WT,n=6）。4.Prdx1过表达大鼠血肿周围组织FJB阳性细胞数量较WT组和Vector组明显减少(比例尺,50μm,df=3,F=435.050,**P<0.01 vs Vector;^##P<0.01 vs WT,n=3),而尼氏染色的阳性细胞较其他两组明显增多(比例尺,50μm,df=3,F=174.206,**P<0.01vs Vector;^##P<0.01 vs WT,n=3)。5.过表达Prdx1后,血肿周围炎症因子IL-6(df=3,F=27.046,*P<0.05 vs Vector;^##P<0.01 vs WT,n=3),IL-10(df=3,F=79.041,**P<0.01 vs Vector,^##P<0.01 vs WT,n=3)及TNF-αmRNA（df=3,F=10.274,**P<0.01 versus Vector;^#P<0.05 versus WT,n=3）水平较WT组和Vector组降低,蛋白水平Bcl-2/Bax较其他两组显著增高（df=3,F=32.759,*P<0.05 vs Vector;^#P<0.05 vs WT,n=3）。第二部分1.RIP-seq测序结果显示,Prdx1共结合10466个RNA,主要结合在这些RNA的编码区、5?非编码区和3?非编码区,GO分析结果显示,这些RNA主要集中在RNA/mRNA加工及剪接。2.RNA-seq数据显示,Prdx1过表达后,共有863个基因发生差异性表达,其中,471个基因上调,392个基因下调。GO分析结果表明,这些RNA主要与氧化还原反应,细胞因子途径,炎症反应,细胞凋亡及DNA修复相关。3.在体和细胞模型验证结果显示,Prdx1可以结合ANGPTL4、GADD45A、THBS1等与炎症反应及细胞凋亡相关的分子,且引起这些分子得差异表达,从而产生抑制炎症反应及细胞凋亡的效果。结论:上述研究表明,脑出血后,血肿周围组织的Prdx1表达显著增高,且高表达的Prdx1主要集中在星形胶质细胞和小胶质细胞。通过在体过表达Prdx1,发现Prdx1可以显著降低脑出血后大鼠的死亡率,改善神经功能缺损,减轻脑水肿及血肿体积,同时可以抑制血肿周围神经细胞变性,抑制炎症反应和细胞凋亡。其主要通过结合炎症反应及细胞凋亡相关的RNA,改变这些RNA的稳定性,引起炎症反应及细胞凋亡相关分子的差异性表达,从而产生抗炎症和细胞凋亡的作用。