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背景和目的:食管癌是世界上最常见的消化道恶性肿瘤,根据病理特征主要分为食管鳞状细胞癌和食管腺癌。中国是食管癌发病风险最高的国家之一,食管鳞状细胞癌一直是中国最常见的病理类型。由于食管鳞状细胞癌早期诊断率低,生物学行为容易局部侵袭和远处转移,患者的远期生存率低,预后很差。食管鳞状细胞癌发生、发展的确切机制复杂,是一个多因素、多步骤的过程,吸烟,基因突变和免疫功能下降都有可能是致癌因素,而基因表达的失控是食管鳞状上皮发生癌变的根本原因。微小RNA(microRNA,miRNA)作为基因表达的重要调控因子,可通过翻译抑制或增加降解靶信使RNA来抑制下游靶基因的表达,从而调节基因的转录和表达。微小RNA在维持细胞周期、细胞分化、凋亡、和信号传导调控中发挥着重要的作用,miR-19b是miR-17-92家族的主要成员之一,是重要的致癌基因,参与了多种恶性肿瘤的发生和发展。PTEN是miR-19b重要的靶基因,miR-19b通过调节PTEN的表达实现对肿瘤细胞生物学行为的影响。但在食管鳞状细胞癌中miR-19b的研究尚未见报道,本研究的目的在于明确miR-19b的表达与食管鳞状细胞癌临床病理参数及预后的关系,探讨miR-19b在食管鳞状细胞癌发生、发展、浸润和转移过程中的调控机制。方法:1、用实时荧光定量PCR法测定42例食管鳞癌患者的癌组织及癌旁组织中miR-19b的表达情况,统计分析miR-19b的表达水平与食管鳞癌临床病理参数及预后的关系。2、通过脂质体转染的方法向Eca109细胞内转染了miR-19b的模拟物(mimics),抑制物(inhibitors)以及其相应的空白对照(negative control,NC),建立Eca109细胞miR-19b高表达与低表达的细胞模型,实时荧光定量PCR检测各组miR-19b的表达量,CCK-8法染色及EdU染色测定各组细胞增殖活性的变化。3、在Eca109细胞的miR-19b模拟物组及抑制物组中,通过划痕实验和transwell实验检测各组细胞侵袭、迁移能力的变化,Western blot检测各组中上皮细胞标志物E-cadherin、间质标志物Vimentin和F-actin的表达水平变化。4、基因数据库在线预测miR-19b可能的靶基因。构建野生型PTEN载体,通过荧光素酶报告观察Eca109细胞中分别转染miR-19b模拟物、抑制物后荧光素酶活性的变化。实时荧光定量PCR及Western blot检测各组中PTEN mRNA和蛋白表达水平的变化。Western blot同时检测食管鳞癌组织和癌旁组织中PTEN蛋白水平差异。5、通过向 Eca109 细胞转染 PTEN siRNA 01 和 PTEN siRNA 02 两个 siRNAs 后,用CCK-8法和划痕实验来验证miR-19b抑制剂对Eca109细胞的增殖和迁移能力的抑制能否被PTEN siRNAs逆转。结果:1、食管鳞癌组织标本中miR-19b的表达水平明显高于癌旁组织(P<0.01);Kaplan-Meier生存分析显示,miR-19b的高表达与食管鳞癌患者总生存率的降低有显著的相关性(P<0.01)。miR-19b的表达与食管鳞癌患者临床病理特征之间关系的统计学分析显示:miR-19b的表达与食管鳞癌患者组织学分级(P=0.04)、淋巴结转移(P=0.0013)显著相关,但与患者的年龄、性别、肿瘤大小、肿瘤浸润程度无明显相关性。2、在Eca109细胞系中,转染miR-19b模拟物后,miR-19b的表达量显著升高,CCK-8法染色和EdU染色均提示细胞增殖活性增加,细胞增殖速度明显加快(P<0.05),miR-19b的表达升高促进了 Eca109细胞的增殖;转染miR-19b抑制物后,miR-19b的表达量显著减少,CCK-8法染色和EdU染色均提示Eca109细胞增殖活性明显降低,细胞增殖受到抑制(P<0.05),沉默miR-19b的表达显著抑制Eca109细胞的增殖。3、划痕实验显示:miR-19b模拟物促进Eca109细胞迁移,miR-19b抑制物抑制Eca109细胞迁移(P<0.05)。Transwell实验显示:当抑制miR-19b的表达后,Eca109迁移细胞数量和侵袭细胞数量明显减少(P<0.05),Eca109细胞迁移和侵袭能力下降。miR-19b的过表达可以导致上皮细胞标志物E-cadherin表达下调,间质标志物Vimentin和Factin表达上调;而沉默miR-19b的表达可以导致E-cadherin表达上调,Vimentin 和 Factin 表达下调(P<0.05)。4、基因数据库在线预测PTEN是miR-19b可能的靶基因。在构建野生型PTEN的载体后,通过荧光素酶报告发现:miR-1 9b的过表达使荧光素酶活性显著降低,而抑制miR-19b的表达使荧光素酶活性显著增强(P<0.05)。同时,miR-19b表达上调后,PTEN mRNA和蛋白的表达显著下降(P<0.05);而沉默miR-19b的表达后,PTEN mRNA和蛋白的表达显著升高(P<0.05)。食管鳞癌组织中PTEN的蛋白水平明显低于癌旁组织(P<0.05)。5、CCK-8法和划痕实验显示PTEN siRNAs明显消除了 miR-19b抑制物(inhibitors)对Eca109的增殖迁移的抑制作用(P<0.05)。结论:1、miR-19b在食管鳞状细胞癌组织中表达上调,其表达水平与组织分化程度、淋巴结转移和预后相关,提示miR-19b可以成为食管鳞状细胞癌早期诊断和预后判断的重要指标。2、miR-19b能促进食管鳞状细胞癌的增殖、迁移和侵袭,提示miR-19b是食管鳞状细胞癌局部浸润和远处转移的重要原因。3、miR-19b能下调上皮标志物E-cadherin的表达,上调间质标志物Vimentin和Factin的表达,提示上皮间质转化可能是miR-19b影响食管鳞状细胞癌生物学行为的重要途径。4、miR-19b能下调食管鳞状细胞癌中PTEN的表达,提示miR-19b在食管鳞状细胞癌中可能通过对PTEN的靶向调控影响食管鳞状细胞癌的生物学行为。