无胆附子炮制工艺研究及其多糖提取和结构表征

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附子是毛茛科植物乌头(Aconitum carmichaeli Debx.)的子根经加工后的中药材,为临床常用中草药,对于缺阳虚脱、胸闷心痛等症效果显著。附子本身为毒性药材,临床应用须经过炮制加工,以降低其自身毒性。传统的炮制需要加入大量胆巴,而胆巴残留对人体会产生毒副作用。在去除胆巴残留的同时,也会导致附子的其他有效成分的减少。附子多糖(Fuzi-polysaccharide,FPS)便是附子的主要活性成分之一,而目前植物多糖是植物活性物质的研究热点。因此,对附子多糖的提取工艺和结构表征开展研究,可阐明附子中活性物质的作用结构基础。为解决胆巴残留并研究附子有效活性成分结构基础,本研究开发了一种无胆附子炮制工艺,并对无胆附子的体外生物活性进行实验研究,进一步对无胆附子多糖的提取工艺进行研究和优化,之后对附子多糖的结构进行表征,主要研究结果如下:(1)无胆附子炮制工艺单因素影响结果显示,干燥的生附片与浸润水量比为1:0.4时,无胆附子中有效成分单酯型生物碱含量值最大,为0.0337%。干燥温度为100℃时,无胆附子单酯型生物碱含量为0.0305%。单因素考察结果结合正交实验,优选无胆附子的最佳的炮制工艺为:干燥生附片与浸润水量比1:0.4,蒸制温度120℃,蒸制时间50 min,干燥温度100℃。此时,无胆附子中单酯型生物碱含量为0.3506%,双酯型生物碱含量为0.0148%,且符合2020年版《中国药典》附子的检测标准要求。(2)无胆附子体外生物活性研究结果表明:无胆附子具备一定体外抗氧化活性,其对DPPH自由基的清除效果可达到98.0%,远高于生附片。无胆附子还具有一定的体外降血糖活性,以阿卡波糖为对照,无胆附子对α-淀粉酶活性抑制效果可达到98.875%,对α-葡萄糖苷酶活性抑制效果达到96.484%。在体外降血脂活性方面,无胆附子药液浓度为4 mg/mL时,与甘氨胆酸钠的结合能力可达到86.66%。无胆附子不同浓度药液对肠道益生菌乳酸乳球菌、屎肠球菌、凝结芽孢杆菌生长的影响,其OD600吸光值呈先增长后降低的趋势,当培养0-12h时,微生物OD600吸光值升高,培养12-28h时,OD600吸光值有所降低。(3)利用超声辅助水提醇沉法,以附子多糖提取率为指标,采用单因素筛选和响应面分析方法优化附子多糖提取工艺。当料液比为1:50时,附子多糖提取率6.75%。超声时长为30min时,附子多糖提取率7.48%。当提取温度为90℃时,附子多糖提取率8.33%。此外,不同体积分数乙醇分级醇沉获得的多糖提取率差异较大,70%-90%体积分数醇沉得到的附子多糖提取率达到6.0%以上。进一步采用Box-Behnken响应面法优选附子的多糖提取最佳工艺为:提取料液比1:50,超声时间20 min,提取时间2 h,醇沉浓度80%,验证实验最终测得多糖提取率为12.47%。(4)经Sevage法脱去附子多糖中蛋白、DEAE纤维素层析法进行附子粗多糖的纯化和分离,得到附子多糖组分FPS-a、FPS-b、FPS-c。进而从分子量、结构特征官能团、糖苷键构型分析、单糖组成和显微结构等方面对附子多糖的结构进行表征。结果表明:附子多糖含有α和β构型的吡喃糖环结构,三种附子多糖组分均不具备三股螺旋结构,其单糖组成中,主要包括葡萄糖,以及少量的阿拉伯糖、木糖等,其中葡萄糖在附子多糖组分FPS-a、FPS-b和FPS-c中的占比较高,分别为72.6%、40.93%、56.65%。附子多糖重均分子量在不同组分中有所差异,FPS-a、FPS-b和FPS-c的重均分子量分别为Mw268345,Mw105007,和Mw200028。附子多糖的微观结构表面呈光滑的片状,带有部分碎屑物;当显微倍数3500倍时,可观察到多糖表面结构疏松,表面附着许多小颗粒。本研究对无胆附子的炮制工艺进行了开发,对无胆附子体外抗氧化、降血糖和降血脂活性以及对微生物生长的影响进行研究。进而对无胆附子多糖提取工艺进行优化并对附子多糖结构进行解析。本研究开发新的附子炮制方式,并初步解析了附子中活性物质成分的基本结构,为附子药材的综合开发利用奠定坚实基础。
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