【摘 要】
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目的:探讨蛇床子素（Osthole,Ost）对鸡等级卵泡颗粒细胞孕酮（Progesterone,P4）分泌的影响。方法:分离培养200日龄海兰褐蛋鸡的等级卵泡颗粒细胞,采用HE染色及间接免疫荧光法进行鉴定;噻唑蓝比色法（MTT）测定Ost对颗粒细胞活力的影响。用不同浓度（5、2.5及1.25μg/m L）的Ost分别作用于颗粒细胞6、12、18及24 h后,ELISA检测颗粒细胞上清中P4含量。用
【基金项目】
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国家重点研发计划（2017YFD0501500）； 山西省重点研发计划项目（201803D221023-3）；
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目的:探讨蛇床子素（Osthole,Ost）对鸡等级卵泡颗粒细胞孕酮（Progesterone,P4）分泌的影响。方法:分离培养200日龄海兰褐蛋鸡的等级卵泡颗粒细胞,采用HE染色及间接免疫荧光法进行鉴定;噻唑蓝比色法（MTT）测定Ost对颗粒细胞活力的影响。用不同浓度（5、2.5及1.25μg/m L）的Ost分别作用于颗粒细胞6、12、18及24 h后,ELISA检测颗粒细胞上清中P4含量。用不同浓度（5、2.5及1.25μg/m L）的Ost作用于颗粒细胞24 h后,ELISA检测颗粒细胞上清中环磷酸腺苷（Cyclic adenosine monophosphate,c AMP）及蛋白激酶A（Protein kinase A,PKA）的含量;实时荧光定量PCR（q RT-PCR）检测类固醇生成急性调节蛋白（Steroidogenic acute regulatory protein,St AR）、细胞色素P450胆固醇侧链裂解酶（Cytochrome P450 cholesterol side chain cleavage,P450scc）、3β-类固醇脱氢酶（3β-hydroxysteroid dehydrogenase,3β-HSD）及增殖细胞核抗原（Proliferating cell nuclear antigen,PCNA）m RNA的相对表达量;Western blot检测St AR,P450scc及3β-HSD的蛋白表达量;活性氧（Reactive oxygen species,ROS）试剂盒检测颗粒细胞的ROS含量。结果:1.分离得到的细胞经HE染色,细胞形态呈多角形或梭形;经间接免疫荧光法检测,细胞中FSHR呈高表达。表明分离提取的细胞为颗粒细胞,可用作后续试验。2.用不同浓度（5、2.5及1.25μg/m L）的Ost分别作用于颗粒细胞6、12、18及24 h后,ELISA检测颗粒细胞上清中P4含量。结果证明,与细胞对照组相比,加入2.5μg/m L的Ost培养24 h后可显著升高细胞上清中P4的含量（P<0.05）。3.鸡等级卵泡颗粒细胞在分别加入5、2.5及1.25μg/m L的Ost培养24 h后,与细胞对照组相比,2.5μg/m L的Ost显著升高颗粒细胞St AR m RNA的相对表达量（P<0.05）;5、2.5及1.25μg/m L的Ost显著升高颗粒细胞P450scc和3β-HSD m RNA的相对表达量（P<0.05）。同时,与细胞对照组相比,三个浓度的Ost均可显著升高颗粒细胞St AR、P450scc和3β-HSD的蛋白表达量（P<0.05）。表明Ost在2.5μg/m L的浓度下,可从基因和蛋白表达水平上调颗粒细胞中St AR、P450scc及3β-HSD的表达量来增加颗粒细胞上清中P4含量。4.鸡等级卵泡颗粒细胞在加入5、2.5及1.25μg/m L的Ost培养24 h后,各组颗粒细胞中PCNA m RNA及ROS的表达量均无显著差异（P>0.05）;各组颗粒细胞c AMP的含量均无显著差异（P>0.05）;与细胞对照组相比,2.5μg/m L的Ost显著升高颗粒细胞的PKA含量（P<0.05）。表明2.5μg/m L的Ost能够通过上调颗粒细胞的PKA含量从而增加颗粒细胞上清中P4含量。结论:2.5μg/m L的Ost作用于颗粒细胞24 h后,可通过上调颗粒细胞PKA含量来升高颗粒细胞中St AR,P450scc及3β-HSD的表达量从而上调P4分泌。
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