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研究目的:通过建立肝癌细胞化疗药物敏感性检测方法,探索不同敏感度化疗药物诱导肝癌细胞株BEL-7402凋亡的作用,以及对免疫刺激“危险信号”热休克蛋白HSP70表达的影响,为建立肝癌的化学免疫治疗新方法提供理论与实验依据。
研究方法:以人肝癌细胞株BEL-7402为研究对象。通过Hoechst33342染色和荧光显微镜观察化疗药物诱导BEL-7402细胞凋亡后的形态学变化;分别以MTT比色法和三磷酸腺苷生物发光法(ATP-TCA)检测BEL-7402细胞对不同化疗药物的敏感性,采用流式细胞术方法检测细胞凋亡;利用直接免疫荧光标记与流式细胞术方法检测不同敏感度化疗药物作用下BEL-7402细胞HSP70表达的情况。
实验结果:1.形态学观察结果化疗药物可以引起肝癌细胞株BEL-7402凋亡的典型形态学变化,以药物处理48h时最为明显。
2.MTT法检测化疗药物对细胞的抑制作用对肝癌细胞株BEL-7402抑制作用较强的药物是足叶乙甙、表阿霉素、泰素等药物,抑制作用较弱的药物是5-FU、丝裂霉素、卡铂等药物。足叶乙甙、表阿霉素、泰素、健择、长春新碱、草酸铂六种药物在三种不同浓度下对肝癌细胞株BEL-7402的抑制率均高于顺铂、5FU、丝裂霉素、卡铂四种药物,差异有统计学意义(P<0.05)。
3.ATP-TCA法检测肝癌细胞株BEL-7402对化疗药物的敏感性肝癌细胞株BEL-7402敏感的药物为:足叶乙甙、表阿霉素;中度敏感的药物为:健择、长春新碱;耐药的药物为:丝裂霉素、卡铂。药敏检测结果与MTT检测结果相符合。
4.流式细胞仪检测化疗药物诱导的肝癌细胞凋亡敏感组药物(足叶乙甙、表阿霉素)诱导肝癌细胞株BEL-7402的凋亡比率显著高于中度敏感组(健择、长春新碱)与耐药组(丝裂霉素、卡铂),差异有统计学意义(P<0.05)。敏感组、中度敏感组、耐药组药物诱导肝癌细胞株BEL-7402的凋亡比率显著高于对照组(P<0.05)。
5.免疫荧光与流式细胞术检测肝癌细胞株BEL-7402HSP70表达情况直接免疫荧光标记结果显示,热休克组与敏感组肝癌细胞株BEL-7402荧光强度强于耐药组(丝裂霉素、卡铂)与对照组;耐药组肝癌细胞株BEL-7402荧光强度与对照组差别不大。
FCM检测结果显示,敏感组肝癌细胞HSP70表达高于耐药组与对照组,差异有统计学意义(P<0.05);且足叶乙甙诱导肝癌细胞HSP70表达显著高于热休克组(P<0.05);耐药组、对照组间HSP70表达差异无统计学意义(P>0.05)。
结论:综合上述实验结果,可以得出以下结论:1.MTT比色法可以很好的应用于化疗药物对肝癌细胞株BEL-7402抑制作用的评价,与ATP-TCA法有很好的一致性。
2.化疗药物可以有效诱导肝癌细胞株BEL-7402细胞凋亡。敏感组药物对肝癌细胞株BEL-7402凋亡的诱导作用显著强于中度敏感组与耐药组药物。肝癌细胞对化疗药物的敏感性与细胞凋亡密切相关。
3.本课题首次研究并发现化疗药物可以有效诱导肝癌细胞株BEL-7402热休克蛋白HSP70的表达。敏感组化疗药物在诱导肝癌细胞明显凋亡的同时也诱导HSP70的高表达,比之热休克方法更加有效。
4.本研究为建立肝癌化学免疫治疗的新方法提供了初步的理论与实验依据;也为采用化疗药物诱导的凋亡细胞作为肿瘤疫苗提供了理论依据。