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目的将体外培养得到的兔骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cellsBMSCs)诱导分化为神经元样细胞,再植入兔颈上交感神经节(Superior cervicalsympathetic ganglion SCSG)损伤模型体内,观察瞳孔的变化,并检测局部组织NGF、VEGF的表达情况,探讨干细胞修复神经损伤的可能机制。方法选取4月大的新西兰兔,取股骨中的骨髓,经体外培养获得BMSCs,并诱导分化为神经元样细胞。利用小号持针器钳压榨兔颈上交感神经节,制备兔颈上交感神经节损伤模型。将健康成年的24只雄性新西兰兔,完全随机的分为四组,A组正常对照组,正常兔,不给于任何处理;B组模型对照组,颈上交感神经节损伤后不给予其他干预;C组培养液干预组,颈上交感神经节损伤后给予细胞培养液干预(不含细胞);D组为BMSCs移植组,颈上交感神经节损伤后给予神经元样细胞移植干预。模型制作成功7天时,C组用微量注射泵经耳缘静脉注入培养液1ml,D组用微量注射泵经耳缘静脉注入浓度为1×109/L的神经元样细胞培养液1ml,分别于移植后1d、3d、7d、14d、21d记录瞳孔的变化,移植21d后,处死兔,取颈上交感神经节,进行HE染色并检测神经生长因子(Nerve growth factor NGF)和血管内皮生长因子(Vascular endothedlial growthfactor VEGF)的表达。结果1、成功的培养了兔BMSCs,利用光学显微镜观察,原代兔BMSCs贴壁较少,大多数呈圆形或者类圆形,小部分呈短梭形,经过纯化、扩增后,贴壁细胞逐渐增多,表现为集落式生长,呈长梭形,局部呈漩涡状;随着传代次数的增加,传至6~7代,细胞生长逐渐缓慢,细胞开始呈扁平状;免疫细胞化学染色检测培养的BMSCs表面特异性标志物:CD34(一),CD54(+)。诱导分化后细胞鉴定多数细胞神经元特异性蛋白和巢蛋白呈阳性表达。2、瞳孔直径比较,在1d、3d、7d、14d、21d时,正常对照组的瞳孔直径(mm)分别为:7.21±0.77、7.72±0.99、7.33±0.35、7.45±0.56、7.41±0.65,模型对照组的瞳孔直径(mm)分别为:5.25±0.30、5.00±0.66、5.27±0.45、5.39±0.24、5.30±0.49,培养液对照组的瞳孔直径(mm)分别为:5.07±0.41、5.32±0.36、5.16±0.43、5.14±0.49、5.41±0.84,BMSCs移植组的瞳孔直径(mm)分别为:5.35±0.34、5.52±0.25、5.40±0.61、6.38±0.60、6.87±0.40。颈上交感神经节损伤后模型对照组、培养液对照组、BMSCs移植组瞳孔和正常对照组比较明显缩小,正常对照组瞳孔几乎无变化,模型对照组、培养液对照组随着时间的推移,瞳孔有所恢复,但变化不明显,BMSCs移植组瞳孔逐渐恢复,在14d时明显变大,21d时恢复更加明显,与正常对照组的差别逐渐变小。同时间点,不同组比较:模型对照组、培养液对照组、BMSCs移植组在1d、3d、7d、14d时间点,瞳孔直径均明显小于正常对照组(P<0.05);21d时间点,模型对照组、培养液对照组明显小于正常对照组、BMSCs移植组(P<0.05),BMSCs移植组与正常对照组比较无明显差异(t=-0.469,P=0.184);同组不同时间点比较:正常对照组、模型对照组、培养液对照组不同时间点比较无明显差异(F=0.483,P=0.748;F=0.618,P=0.0.654;F=0.407,P=0.802)。BMSCs移植组不同时间点比较,差异明显(F=13.150,P=0.000),14d、21d瞳孔直径明显高于1d、3d、7d(P<0.05),14d与21d比较,瞳孔直径差异不明显(t=-0.486,P=0.080)。3、神经节HE染色显示:光镜下正常对照组:神经细胞较多,细胞形态正常,大小一致,均匀分布,间质中几乎没有血管走形;模型对照组:神经元稀疏,细胞大小不一致,分布不均匀,多数细胞胞浆明显减少、细胞核固缩,细胞间质增生明显,间质中见少量血管增生;培养液对照组:细胞形态、间质及血管增生情况和模型自然恢复对照组大致相当。BMSCs移植组:细胞形态大致,大小及分布较一致,少量细胞细胞核固缩,间质增生不明显,但间质中可见大量血管走形。4、NGF免疫组化染色(单位:个):NGF阳性细胞数分别为:正常对照组:47.22+13.48,模型对照组:51.10+9.93,培养液对照组:56.63+7.96,BMSCs移植组:101.49+11.79。NGF阳性细胞数表达呈上升趋势,组间比较有差异(F=31.615,P=0.000),BMSCs移植组明显高于正常对照组、模型对照组、培养液对照(t=54.267,P=0.000;t=50.382,P=0.000;t=44.859,P=0.000);正常对照组、模型对照组、培养液对照组两两比较差异不明显(P>0.05)。5、VEGF免疫组化染色(单位:个):VEGF阳性细胞数分别为:正常对照组:13.46+2.68,模型对照组:17.62+7.22,培养液对照:18.91+7.26,BMSCs移植组:35.61+3.24。VEGF阳性细胞数表达呈上升趋势,组间比较有差异(F=18.634,P=0.000),BMSCs移植组明显高于正常对照组、模型对照组、培养液对照组(t=22.147,P=0.000;t=17.987,P=0.000;t=16.693,P=0.000);正常对照组、模型对照组、培养液对照组两两比较差异不明显(P>0.05)。结论1:兔骨髓间充质干细胞对兔颈上交感神经节损伤有修复作用。2:兔骨髓间充质干细胞修复神经损伤的机制之一可能是通过分泌NGF,VEGF等神经营养因子实现的。