超声辅助桑叶黄酮提取纯化及抑制黄嘌呤氧化物酶活性研究

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桑叶在我国具有悠久的使用历史,是第一批被国家卫生健康委员会批准的药食两用品种。桑叶中的活性物质对抗氧化、降血糖、降血脂有着明显的作用,黄酮是桑叶中的主要活性物质之一,已经作为天然的色素、抗氧化剂使用到食品和化妆品等领域。本研究立足于桑叶更好的开发利用,研究了桑叶黄酮的提取和纯化,对桑叶黄酮的抗氧化性和黄嘌呤氧化物酶抑制性进行分析。使用LC-MS/MS的方法,定性分析桑叶黄酮中的化合物。此外,通过分子对接研究了三种黄酮类化合物(Rutin,Isoquercetin,Astragalin)与黄嘌呤氧化物酶活性位点的结合模式。研究结果对提升桑叶的经济价值有一定的促进作用,证明桑叶可作为一种预防或治疗痛风的潜在药物或功能性食品进行开发。将桑叶干燥粉碎,使用超声波辅助提取法从桑叶中提取总黄酮。通过单因素实验,响应面实验优化得到最佳提取工艺条件。结果表明,最佳的提取工艺为乙醇浓度80%,料液比1:30(g/mL),超声时间75min,超声温度40°C,提取率可达2.694%。将桑叶黄酮的粗提取物经过3次醇沉后,用大孔树脂进行再次纯化。运用静态吸附结合动态吸附的方法对纯化的工艺条件进行研究。实验结果表明,最佳的工艺条件为,上样液浓度1mg/mL,pH=4,上样流速2mL/min,洗脱液为70%的乙醇溶液,洗脱流速2mL/min,纯度由12.3%提高到33.8%。运用LC-MS/MS的实验方法,对桑叶黄酮进行定性分析,采用0.1%甲酸水溶液(溶剂A)和乙腈(溶剂B)组成流动相。一共鉴定出12种化合物,包括6种黄酮、5种酚酸和1种香豆酸。对桑叶黄酮的体外抗氧化性实验,通过三种不同的方法测定,即清除超氧化物,过氧化氢和羟基自由基的实验,以抗坏血酸为阳性对照。结果显示桑叶黄酮IC50分别为0.33±0.006mg/mL,45±0.8μg/mL和2.54±0.05mg/mL。桑叶黄酮和黄酮单体化合物对黄嘌呤氧化物酶的抑制实验,表明桑叶黄酮、Rutin、Isoquercetin、Astragalin对黄嘌呤氧化物酶具有一定的抑制作用,其中桑叶黄酮和Rutin的抑制活性较高。运用Discovery Studio 2.5软件进行分子对接的研究结果表明,Rutin,Isoquercetin,Astragalin均能通过氢键和π-π堆积与黄嘌呤氧化物酶作用,使其丧失部分活性。桑叶黄酮抑制黄嘌呤氧化物酶酶动力学抑制实验结果表明,桑叶黄酮表现为可逆的混合型竞争性抑制。
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