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鸭传染性浆膜炎是由鸭疫里氏杆菌（Riemerella anatipestifer,RA）引起的急性、接触性、败血性传染病,该病主要发生在1-8周龄的鸭,尤其是2-3周龄的雏鸭最易感。该病以纤维素性心包炎、肝周炎、气囊炎和脑膜炎为特征,是目前危害养鸭业最为严重的细菌性传染病之一。当前已报道的RA血清型至少有21种,各个血清型之间缺乏有效的交叉保护,患病鸭因死亡率高、生长迟缓、品质下降、饲料报酬率低和治疗费用增加等,给养鸭业造成了巨大的经济损失。本课题组前期经生物信息学分析,预测RAYM＿RS09735和RAYM＿RS09740为鸭疫里氏杆菌的一对经典双组份系统（Two component system,TCS）,构建了一株鸭疫里氏杆菌YMΔRS09735/RS09740双基因缺失突变株,与亲本株相比,YMΔRS09735/RS09740突变株对雏鸭的毒力显著降低。但是该TCS对鸭疫里氏杆菌毒力的调控机制仍然不清楚。本研究的主要内容与结果如下:1. RAYM＿RS09735/RAYM＿RS09740基因缺失突变株转录组学分析及其对鸭疫里氏杆菌RA-YM株基因表达的影响转录组测序结果显示在该双组份缺失株中有112个基因上调,693个基因下调。随机挑选10个差异基因,利用荧光定量PCR对转录组测序结果进行验证,结果显示荧光定量PCR结果与转录组测序结果相符,确认了RNA＿seq数据的准确性。GO富集分析表明差异表达的基因主要涉及生物过程、细胞成分和分子功能等方面。KEGG通路分析显示RAYM＿RS09740为PhoP蛋白,RAYM＿RS09735为PhoR蛋白,这表明RAYM＿RS09735和RAYM＿RS09740组成了PhoP/PhoR双组份系统,该双组份系统为革兰阴性菌中首次报道的一对新双组份系统。转录组数据分析发现缺失株中肽聚糖水解酶Nlp/P60基因的表达显著下调。利用原核表达纯化的PhoP蛋白,通过凝胶迁移实验发现PhoP蛋白在体外可以与Nlp/P60基因启动子序列结合,说明PhoP蛋白能直接调控Nlp/P60基因的表达。构建了Nlp/P60基因缺失株,雏鸭感染实验结果表明其毒力与亲本株相比下降了约1.33倍,说明Nlp/P60基因为鸭疫里氏杆菌的毒力相关基因。2. 鸭疫里氏杆菌RA-YM株phoP、phoR基因缺失突变株的构建及其对鸭疫里氏杆菌基因表达的影响采用接合转移的方法分别构建了ΔphoP、ΔphoR基因缺失突变株,二者与RA-YM亲本株在液体培养基中的生长速度无显著性差异。毒力测定结果显示亲本株RA-YM、ΔphoP、ΔphoR基因缺失株的LD50分别为3.98×104CFU、1.88×109CFU和4.22×109CFU。ΔphoP、ΔphoR基因缺失株的毒力分别较亲本株下降了约4.7×104倍和1.0×105倍。组织器官载菌量测定结果显示ΔphoP、ΔphoR基因缺失株的载菌量均较亲本株显著降低,ΔphoP、ΔphoR基因缺失株感染雏鸭后均未见明显的组织病变,说明phoP、phoR基因均与RA-YM株的毒力密切相关。通过对RA-YM株和ΔphoP、ΔphoR基因缺失株转录组差异基因比较分析,结果显示phoP基因缺失株与亲本株RA-YM相比表达差异在2倍或2倍以上的基因共186个,其中表达上调基因126个,表达下调基因60个;phoR基因缺失株与亲本株RA-YM相比表达差异在2倍或2倍以上的基因共243个,其中表达上调基因97个,表达下调基因146个。3. RAP44噬菌体整合酶介导的鸭疫里氏杆菌50K基因岛整合研究通过转录组学生物信息分析发现双基因缺失株有78个连续基因差异表达,该78个连续基因位于50Kb的基因簇区域,两端含有19bp直接重复序列,且位于t RNA-Ser下游,将该段基因簇命名为50K基因岛。通过全基因组序列比对发现鸭疫里氏杆菌RA-YM、HXb、Yb2、RA-GD、ATCC 11845、CH-3、CH-1等强毒株中均含有部分或者完整的该基因岛,且该基因岛来源于鸭疫里氏杆菌烈性噬菌体RAP44。研究发现该基因岛具有整合和外切的功能,能形成中间环化分子,其整合酶与Cre酶结构相似。利用其整合特性,构建了重组自杀整合质粒p RE112-Spec-int,通过接合转移导入鸭疫里氏杆菌,发现该整合酶介导了精确的位点特异性整合。4. 介导鸭疫里氏杆菌10K基因岛精确整合和切除整合酶的鉴定通过生物信息学分析发现鸭疫里氏杆菌标准菌株ATCC 11845除了有50K基因岛外,还存在另一个10K基因岛,但RA-YM菌株不含有该基因岛。利用10K基因岛整合酶的整合特性,通过接合转移导入RA-YM菌株构建了稳定的整合菌株,应用PCR检测发现该整合酶介导了精确的整合和外切。进一步利用该特性构建了稳定表达e GFP蛋白的鸭疫里氏杆菌RA-YM重组菌株。综上所述,本研究首次阐明了PhoP/PhoR TCS在调控鸭疫里氏杆菌基因表达中的作用,为深入研究该TCS调控鸭疫里氏杆菌毒力的机制提供了新的视角。研究并利用基因岛整合酶功能建立了鸭疫里氏杆菌稳定的遗传操作系统,为外源基因的表达和互补菌株的构建提供了新的方法,同时为鸭疫里氏杆菌基因组的水平转移和进化提供了依据。