研究背景及目的:由于环境、遗传、生活方式等因素的影响,男性生育能力明显下降,男性不育已经成为继肿瘤、心血管疾病之后的第三大影响人类健康的疾病。精子发生是研究男性不育发病机制的基础,因此精原干细胞作为精子发生的起始细胞,承担着自我更新以维持干细胞池稳态和分化生成各级生殖细胞的功能,对再生医学和生殖医学领域有着重要的研究意义。然而,目前,人们对人精原干细胞的研究十分有限,主要由于人精原干细胞取材困难,数量有限以及体外长期培养体系的缺乏。因此,急需建立一个永生化的人精原干细胞系来获得足够数量的人精原干细胞用于基础研究和临床应用。此外,精原干细胞自我更新和分化的分子调控机制的相关研究大多局限于单基因或单信号通路,近年研究发现,微阵列技术能够大规模发现不同组织和细胞的基因表达特征和基因功能,揭示特定生物学过程以及疾病发生过程中的分子机理。因此,本研究的研究目的有:1)构建具有无限增殖能力的人类精原干细胞系;2)揭示人类精原干细胞增殖的基因调控机制。方法:首先,我们过表达SV40大T抗原基因构建永生化的人精原干细胞系。应用RT-PCR、蛋白免疫印迹（Western blots）、免疫细胞化学（Immunocytochemistry）等方法,检测该细胞系是否表达人精原细胞与人精原干细胞的基因与蛋白。随后,我们运用细胞增殖实验（CCK-8）并检测PCNA的表达,分析人精原干细胞系的增殖能力。并且,我们通过干细胞移植实验对该细胞系进行了功能验证。此外,我们还通过细胞的核型分析、Y染色体微缺失、裸鼠成瘤实验等方法,评估了人精原干细胞系的安全性。最后,我们通过GDNF、EGF、b FGF促进人精原干细胞系的增殖,应用微阵列技术（Microarray technology）、定量PCR和生物信息学技术对影响人精原干细胞增殖的大量基因及其信号通路进行了筛选和分析。结果:我们过表达SV40大T抗原基因所构建的细胞系能够表达人精原细胞及人精原干细胞的特异性标志物,包括:VASA、DAZL、MAGEA4、GFRA1、RET、UCHL1、GPR125、PLZF和THY1,表明该细胞系在生化表型上具有人类精原干细胞的基因与蛋白。免疫细胞化学显示,该细胞系表达PCNA;CCK-8细胞增殖实验表明,该细胞系能够在体外长期扩增长达1.5年以上,并具有较强的增殖能力。细胞移植实验进一步发现,人精原干细胞系在受体小鼠睾丸内表达UCHL1、PCNA、MAGEA4,表明其在体内具有增殖和克隆能力。尽管我们所构建的人精原干细胞系存在一些异常的染色体核型,但是,该细胞系没有Y染色体基因的微缺失,并且,它不产生肿瘤,表明该细胞系有较好的安全性。微阵列分析结果显示,GDNF、EGF、b FGF介导下的人精原干细胞系共有1172个基因发生了改变。随后,我们应用KEGG通路分析对这些差异表达的基因所富集的通路进行了分析。最后,我们筛选到了ID1作为候选基因,结果表明,ID1可能是参与人精原干细胞增殖的关键基因,但其调控的具体机制需进一步研究。结论:我们首次成功地构建了人精原干细胞系,此细胞系具有无限增殖能力并且有较好的安全性,为人精原干细胞的机制研究和转化医学提供了无限的细胞来源。后续的机制研究发现,多种基因和信号通路可能参与人精原干细胞的自我更新和增殖,ID1可能是人精原干细胞自我更新和增殖过程中的关键基因。