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目的:食管癌是全球第四大恶性肿瘤,是癌症死亡的第六大常见原因,极大的威胁了人类的健康。食管癌患者就诊时常已处于局部晚期,手术治疗效果不佳。许多患者最终不可避免的出现复发和转移。因此需要探寻更加易于接受的早期诊断的方法,并尝试寻找到潜在的治疗新靶点。外泌体通过传递活性分子来介导癌症中的细胞间通信。在癌症发生的早期,肿瘤细胞常常会处于上皮样状态,当肿瘤发生进展之后,肿瘤细胞则将会拥有更多的间充质特征,这一过程称为上皮-间充质化（epithelial mesenchymal transformation,EMT）。EMT是一个连续的过程,在所有癌症的发展中是不可或缺的。外泌体可以通过诱导EMT促进多种癌细胞进展、转移和耐药。在恶性肿瘤早期,正常成纤维细胞（normal fibroblasts,NFs）具有通过阻止肿瘤细胞中的EMT和诱导G1/S细胞周期停滞而起到抑制肿瘤的作用,但是随着肿瘤不断进展,这些静止的NFs会被肿瘤细胞释放的信号激活,导致它们分化为肿瘤相关成纤维细胞（cancer-associated fibroblasts,CAFs）,进而CAFs分泌的外泌体可以诱导肿瘤细胞EMT。然而,CAFs来源的调控食管鳞状细胞癌（Esophageal squamous cell carcinoma,ESCC）转移的分子决定因素尚未被完全确定。本研究利用食管鳞状细胞癌组织标本、食管鳞状细胞癌细胞株TE-1细胞及Eca-109细胞进行生物信息学、分子生物学技术、动物试验技术研究,分别从整体、细胞和基因水平及动物模型中探讨CAFs外泌体在食管鳞状细胞癌上皮-间充质化中的作用及其调节机制。使用透射电子显微镜（Transmission electron microscope,TEM）和纳米颗粒跟踪分析（Nanoparticle Tracking Analysis,NTA）技术鉴定了外泌体的特征。方法:本研究利用食管鳞状细胞癌组织和正常组织分离提取培养CAFs和NFs细胞,观察CAFs外泌体对食管鳞状细胞癌细胞株EMT的影响。利用RT-PCR技术对CAFs和NFs细胞进行LINC01410含量检测。接下来我们对提取出的外泌体和经外泌体孵育的TE-1细胞中LINC01410含量分别进行了检测,运用生物信息学分析技术对LINC01410的潜在作用靶点进行分析并探索LINC01410发挥调控肿瘤细胞迁移及诱导肿瘤细胞发生上皮-间充质转化作用的分子机制。接下来利用LINC01410-OE、mi R-122-5p mimic及PKM2-OE转染高分化食管鳞状细胞TE-1细胞和低分化食管鳞状细胞癌Eca-109细胞,使用q RT-PCR检测LINC01410、mi R-122-5p和PKM2在TE-1或Eca-109细胞中的转染效率。采用Transwell实验检测肿瘤细胞迁移和侵袭能力。使用Western Blot检测LINC01410-OE组、LINC01410-OE+mi RNA mimic+PKM2 NC-OE组和LINC01410-OE+mi RNA mimic+PKM2-OE组EMT相关蛋白的表达情况。并进行补救试验来进一步明确CAFs外泌体调控肿瘤细胞上皮间充质转化的过程。最后通过裸鼠成瘤实验,对敲低LINC01410抑制mi R-122-5p表达进行验证,证实LINC01410-mi R-122-5p/PKM2轴调节食管鳞状细胞癌细胞发生上皮-间充质化从而调节肿瘤进展的机制。结果:1 CAFs外泌体促进食管鳞状细胞癌迁移、侵袭和上皮-间充质化1.1 CAFs外泌体促进食管鳞状细胞癌转移我们首先研究了癌组织和癌旁正常组织中成纤维细胞的异同,结果证实本研究细胞分离纯化成功,分离出来的原代培养细胞分别为人食管鳞状细胞癌相关成纤维细胞（CAFs）和正常成纤维细胞（NFs）。接下来我们将食管鳞状细胞癌TE-1细胞株在上述两种成纤维细胞的条件培养基上进行共培养后,通过Transwell小室对细胞迁移和侵袭能力进行检测,结果提示,CAF可显著提高食管鳞状细胞癌TE-1细胞株细胞的迁移和侵袭能力。而运用外泌体抑制剂后,TE-1/CAF细胞的迁移和侵袭能力明显下降。通过电镜技术观察外泌体的大小和形态,纳米颗粒跟踪分析技术测量外泌体的粒径分布和免疫印迹技术测定外泌体相关蛋白。利用激光共聚焦显微镜在外泌体摄取检测中探测到了食管鳞状细胞癌TE-1细胞株细胞对外泌体的摄取。1.2 CAFs外泌体促进食管鳞状细胞癌上皮-间充质化。对TE-1细胞株细胞的EMT标记物结果显示与TE-1/NF相比,TE-1/CAF的PKM2、snail、Vimentin表达明显升高,而E-钙粘蛋白表达降低。2 CAFs外泌体LINC01410促进食管鳞癌细胞上皮-间充质化2.1 LINC01410在食管鳞状细胞组织及成纤维细胞外泌体中的表达RT-PCR技术对食管鳞状细胞癌组织及癌旁组织中LINC01410含量进行检测,结果显示,与癌旁组织相比,食管鳞状细胞癌组织中LINC01410含量显著增加。接下来,我们对培养的NFs和CAFs细胞中LINC01410含量同样进行了RT-PCR检测,结果显示CAFs中LINC01410的表达水平显著高于NFs中的表达水平。此外,我们平行对NFs和CAFs来源的外泌体中及外泌体孵育的TE-1细胞中LINC01410含量分别进行了检测,结果显示CAFs中LINC01410的表达水平显著高于NFs中的表达水平。2.2 CAFs外泌体LINC01410促进食管鳞状细胞癌转移和上皮-间充质化Transwell迁移实验结果显示过表达LINC01410显著促进了TE-1细胞的迁移和侵袭,而敲低LINC01410则对TE-1细胞的迁移和侵袭产生抑制作用。接下来我们将CAFs外泌体与TE-1细胞共培养,结果显示,过表达LINC01410的外泌体显著促进了TE-1细胞的迁移和侵袭,反之则减弱了细胞的迁移和侵袭力。Western blot检测显示在过表达LINC01410的细胞中,Snail、Vimentin及PKM2蛋白表达上调,E-cadherin表达下调。而敲低LINC01410则上调E-cadherin表达,抑制Snail、Vimentin及PKM2蛋白的表达。2.3 LINC01410吸附mi R-122-5p促进PKM2的表达利用DIANA数据库对LINC01410的潜在作用靶点生物信息学分析表明,LINC01410包含了与mi R-122-5p结合的潜在位点。用双荧光素酶报告基因进行验证显示,mi R-122-5p显著降低了LINC01410-WT组荧光素酶的活性,但对LINC01410-MUT组的荧光素酶活性无显著影响。除此之外,RIP检测结果显示,LINC01410和mi R-122-5p均在TE-1细胞中富集,且与Ago2蛋白有相互作用,具有生物活性。在对参与肿瘤细胞迁移和上皮-间充质化的下游分子预测结果中显示,PKM2与mi R-122-5p具有潜在的结合靶点。同样,我们通过双荧光素酶报告基因显示,mi R-122-5p显著降低了PKM2-WT组荧光素酶的活性,但对PKM2-MUT组的荧光素酶活性无显著影响。此外,RNA pull-down结果表明与对照相比,mi R-122-5p与PKM2结合显著增多。3 CAFs外泌体LINC01410通过mi R-122–5p/PKM2轴促进食管鳞癌细胞迁移及上皮-间质化3.1 CAFs外泌体通过LINC01410/mi R-122-5p/PKM2促进食管鳞状细胞癌迁移用LINC01410-OE、mi R-122-5p mimic及PKM2-OE转染高分化食管鳞癌细胞系TE-1和低分化食管鳞癌细胞系Eca-109进行补救实验。运用q RT-PCR对LINC01410、mi R-122-5p和PKM2在TE-1或Eca-109细胞中的转染效率及相互关系进行检测,结果显示,转染后的细胞中相应的LINC01410、mi R-122-5p和PKM2表达均升高,而且过表达LINC01410后可发挥分子海绵作用吸附mi R-122-5p,降低mi R-122-5p表达。运用Transwell实验对补救表达LINC01410、mi R-122-5p及PKM2后对TE-1和Eca-109细胞迁移力和侵袭力进行检测,结果显示,补救表达LINC01410组细胞迁移和侵袭力显著增高,而补救表达mi R-122-5p组则逆转细胞迁移和侵袭力。以上结果证明,CAFs外泌体中LINC01410可通过吸附mi R-122-5p促进PKM2诱导的肿瘤细胞发生迁移和侵袭。3.2 CAFs外泌体通过LINC01410/mi R-122-5p/PKM2促进食管鳞状细胞癌上皮-间充质化对肿瘤细胞上皮-间充质化的标志物Snail、Vimentin和E-cadherin及PKM2蛋白含量进行检测,结果显示补救表达LINC01410组中PKM2、Snail、Vimentin蛋白表达显著增高,E-cadherin蛋白含量显著降低,补救表达PKM2后同样使PKM2、Snail、Vimentin蛋白表达显著增高,E-cadherin蛋白含量显著降低。同样的结果在低分化的Eca-109细胞系中得到验证。3.3 CAFs外泌体通过LINC01410/mi R-122-5p/PKM2促进小鼠体内食管鳞状细胞癌迁移和发生上皮-间充质化裸鼠通过皮下注射稳定转染的CAFs（NC-KD和LINC01410-KD）和TE-1（antogomir-NC组和antogomir-mi R-122）细胞构建了食管鳞状细胞癌小鼠模型,在皮下移植40天后LINC01410-KD+antogomir-NC组的平均肿瘤体积明显小于NC-KD+antogomir-NC组,而NC-KD+mi R-122-5p抑制组的平均肿瘤体积则明显增加,LINC01410-KD+mi R-122-5p抑制组的肿瘤体积大小介于上述两组之间。肿瘤的重量与其体积得到一致的结论。运用q RT-PCR和Western blot对肿瘤组织中LINC01410、mi R-122-5p及上皮间-充质化的相关分子进行检测,结果显示LINC01410的表达在LINC01410-KD+antogomir-NC及LINC01410-KD+mi R-122-5p抑制组中被降低而mi R-122-5p则被增强。同时Western blot结果表明PKM2、Snail、Vimentin的表达水平在LINC01410-KD组被抑制而在mi R-122-5p抑制组中表达升高。结论:1.CAFs外泌体促进食管鳞状细胞癌细胞发生上皮-间充质转化。2.CAFs外泌体可能通过LINC01410-mi R-122-5p-PKM2轴参与调控肿瘤细胞上皮-间充质转化过程。3.CAFs外泌体能通过LINC01410-mi R-122-5p-PKM2轴的表达参与食管鳞状细胞癌细胞中EMT调控,从而调节肿瘤的迁移和侵袭。这些研究结果支持LINC01410在食管鳞状细胞癌中发挥致癌作用,并可能作为食管鳞状细胞癌潜在的诊断生物标志物和食管鳞状细胞癌治疗的新靶点。