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研究背景:哺乳动物在长期的不活动式肢体固定状态下其骨骼肌会造成胞浆钙超载,随着骨骼肌胞浆钙离子浓度地不断增加,大量的钙离子进入线粒体会造成线粒体基质钙超载,导致线粒体功能障碍、损伤甚至崩解,进而引起细胞凋亡,发生严重的废用性肌肉萎缩。本课题组的前期研究表明,冬眠动物存在独特的保护机制,可使其在长期的不活动期间保持骨骼肌纤维胞浆钙离子浓度维持在正常水平,抑制废用性肌萎缩造成的相关损伤,然而对于冬眠动物骨骼肌纤维线粒体在维持其胞浆钙当中的作用以及线粒体基质钙的调控机制尚不明晰,亟待研究。研究目的:通过测定冬眠不同时期达乌尔黄鼠(Spermophilus dauricus)比目鱼肌和趾长伸肌中线粒体钙离子水平,以及比目鱼肌和趾长伸肌中线粒体钙运输相关蛋白在基因水平和蛋白水平的变化,研究冬眠达乌尔黄鼠骨骼肌纤维线粒体钙稳态调控的分子机制。研究方法:1.通过激光共聚焦技术测定比目鱼肌和趾长伸肌线粒体钙离子浓度;2.通过实时荧光定量PCR技术测定比目鱼肌和趾长伸肌摄钙通道MCU、MICUI、MICU2和降钙通道Letm1 mRNA水平的相对表达量;3.通过Western Blot技术测定比目鱼肌和趾长伸肌摄钙通道MCU、MICU1和降钙通道Letm1蛋白水平的相对表达量。研究结果:1.肌重体重比的变化:与冬眠前组相比,达乌尔黄鼠冬眠中组比目鱼肌和趾长伸肌的肌重体重比未发生明显变化。与冬眠前组、冬眠中组和阵间觉醒组相比,出眠组比目鱼肌肌重体重比分别升高 55.65%(P<0.01)、38.22%(P<0.01)和 31.34%(P<0.01),出眠组趾长伸肌肌重体重比分别升高23.02%(P<0.01)、32.07%(P<0.01)和18.97%(P<0.05)。2.达乌尔黄鼠冬眠阵周期统计:达乌尔黄鼠平均冬眠时长为138.60±23.81天,其中冬眠时间约占89.75%,觉醒时长约占10.25%。除去冬眠前组,达乌尔黄鼠的冬眠阵时长为11.84±6.94天。达乌尔黄鼠的阵间觉醒时长为1.36±0.86天。出眠达乌尔黄鼠的冬眠阵个数为9.00±1.77个。3.线粒体Ca2+浓度的变化:冬眠不同时期达乌尔黄鼠比目鱼肌线粒体Ca2+浓度没有显著变化(P>0.05)。与冬眠前组相比,趾长伸肌线粒体Ca2+浓度在冬眠中组和出眠组分别显著升高3.11%(P<0.01)和3.61%(P<0.01),与冬眠中组相比,Ca2+浓度在阵间觉醒组中显著降低了 3.54%(P<0.01)。与阵间觉醒组相比,趾长伸肌线粒体Ca2+浓度在出眠组中显著升高了 4.12%(P<0.01)。4.冬眠不同时期线粒体运输蛋白MCU、MICU1、MICU2和Letm1 mRNA表达水平的变化:与冬眠前组相比,达乌尔黄鼠比目鱼肌中MCU mRNA表达水平在冬眠中组升高了 14.70%(P<0.01),阵间觉醒组和出眠组分别降低了 34.71%(P<0.01)和82.73%(P<0.01)。与冬眠中组相比,阵间觉醒组和出眠组分别降低了 43.08%(P<0.01)和84.94%(P<0.01)。与阵间觉醒组相比,出眠组降低了 73.55%(P<0.01)。与冬眠前组相比,冬眠中组、阵间觉醒组和出眠组MICU1 mRNA表达水平分别升高了 1.37倍(P<0.01)、2.07倍(P<0.01)和1.65倍(P<0.01)。与冬眠中组相比,阵间觉醒组升高了 29.18%(P<0.01)。与阵间觉醒组相比,出眠组降低了 13.59%(P<0.01)。与冬眠前组相比,冬眠中组、阵间觉醒组和出眠组MICU2 mRNA表达水平分别降低了 54.56%(P<0.01)、45.51%(P<0.01)和 74.09%(P<0.01)。与冬眠中组和阵间觉醒组相比,出眠组分别降低了 42.98%(P<0.05)和52.45%(P<0.05)。与冬眠前组相比,冬眠中组、阵间觉醒组和出眠组达乌尔黄鼠比目鱼肌Letm1 mRNA表达水平分别降低了 52.79%(P<0.01)、41.99%(P<0.01)和 81.89%(P<0.01)。与冬眠中组相比,阵间觉醒组升高了 22.89%(P<0.01),出眠组降低了 61.64%(P<0.01)。与阵间觉醒组相比,出眠组降低了 68.78%(P<0.01)。与冬眠前组相比,达乌尔黄鼠趾长伸肌中MCU mRNA表达水平在冬眠中组和出眠组分别降低了 20.20%(P<0.01)和79.08%(P<0.01)。与冬眠中组相比,阵间觉醒组升高了 17.18%(P<0.01),出眠组降低了 73.78%(P<0.01)。与阵间觉醒组相比,出眠组降低了 77.62%(P<0.01)。与冬眠前组相比,阵间觉醒组和出眠组达乌尔黄鼠趾长伸肌MICU1 mRNA表达水平分别降低了 14.47%(P<0.05)和67.20%(P<0.01)。与冬眠中组相比,阵间觉醒组和出眠组分别降低了 12.41%(P<0.05)和66.41%(P<0.01)。与阵间觉醒组相比,出眠组降低了 61.65%(P<0.01)。与冬眠前组相比,阵间觉醒组和出眠组达乌尔黄鼠趾长伸肌MICU2 mRNA表达水平分别降低了29.43%(P<0.01)和69.53%(P<0.01)。与冬眠中组相比,阵间觉醒组和出眠组分别降低了 23.08%(P<0.01)和66.78%(P<0.01)。与阵间觉醒组相比,出眠组降低了 56.82%(P<0.01)。与冬眠前组相比,冬眠中组和出眠组达乌尔黄鼠趾长伸肌Letm1 mRNA表达水平分别降低了 20.74%(P<0.01)和74.04%(P<0.01)。与冬眠中组相比,阵间觉醒组升高了 20.50%(P<0.01),出眠组降低了 67.25%(P<0.01)。与阵间觉醒组相比,出眠组降低了 72.82%(P<0.01)。5.冬眠不同时期线粒体运输蛋白MCU、MICU1、和Letm1蛋白表达水平的变化:与冬眠前组和冬眠中组相比,达乌尔黄鼠阵间觉醒组比目鱼肌中MCU的蛋白表达分别显著降低了 58.08%(P<0.01)和63.64%(P<0.01),与阵间觉醒组相比,出眠组显著升高了 233.54%(P<0.01)。与冬眠前组相比,达乌尔黄鼠冬眠中组、阵间觉醒组和出眠组比目鱼肌MICU1的蛋白表达分别显著升高了 125.22%(P<0.01)、83.52%(P<0.05)和384.31%(P<0.01),与冬眠中组和阵间觉醒组相比,达乌尔黄鼠出眠组分别显著升高了 115.04%(P<0.01)和163.91%(P<0.01)。与冬眠前组相比,达乌尔黄鼠阵间觉醒组比目鱼肌Letm1蛋白表达量显著降低了 44.42%(P<0.01),出眠组蛋白表达量显著升高了 217.80%(P<0.01)。与冬眠中组和阵间觉醒组相比,出眠组蛋白表达量分别显著升高了 349.27%(P<0.01)和471.80%(P<0.01)。与冬眠前组相比,达乌尔黄鼠冬眠中组趾长伸肌MCU蛋白表达显著升高了 60.76%(P<0.01)。与冬眠中组相比,达乌尔黄鼠阵间觉醒组和出眠组MCU蛋白表达分别显著降低了 43.50%(P<0.01)和56.11%(P<0.01)。与冬眠前组相比,达乌尔黄鼠冬眠中组趾长伸肌MICU1蛋白表达显著升高了 19.51%(P<0.05)。与冬眠中组相比,出眠组MICU1蛋白表达显著降低了 26.21%(P<0.01)。与冬眠前组相比,达乌尔黄鼠冬眠中组趾长伸肌Letm1蛋白表达显著升高了 78.60%(P<0.01),而阵间觉醒组和出眠组分别显著降低了 41.34%(P<0.01)和39.23%(P<0.01)。与冬眠中组相比,阵间觉醒组和出眠组Letm1蛋白表达分别显著降低了 67.15%(P<0.01)和65.98%(P<0.01)。研究结论:1.冬眠过程中达乌尔黄鼠比目鱼肌与趾长伸肌的肌重体重比未发生明显变化,出眠时则明显上升。这也是其骨骼肌未发生萎缩的直接证据。2.冬眠不同时期达乌尔黄鼠比目鱼肌线粒体Ca2+浓度没有发生变化。趾长伸肌线粒体Ca2+浓度在冬眠中组和出眠组明显升高,胞浆钙超载时,线粒体可临时充当储钙细胞器。需要储钙时优先使用快肌的线粒体,保证慢肌功能和钙稳态的维持。3.与冬眠前组相比,阵间觉醒组线粒体摄钙转运蛋白MCUmRNA相对表达含量的下调(比目鱼肌)或维持(趾长伸肌),MICU1和MICU2的下调(趾长伸肌和比目鱼肌),以及降钙转运蛋白Letm1mRNA相对表达含量与冬眠组相比有所上调,可能是骨骼肌线粒体维持钙稳态的途径之一。4.摄钙通道MCU和MICU1在冬眠期间蛋白表达含量都显著升高,提示线粒体参与胞浆钙稳态的调控,阵间觉醒期间MCU和MICU1蛋白表达量的下调,提示下调MCU和MICU1是达乌尔黄鼠避免线粒体基质钙离子浓度超载的重要机制,冬眠中维持(比目鱼肌)或上调(趾长伸肌)降钙通道Letm1蛋白表达水平可能是其避免线粒体基质钙超载的又一途径。