西红花(Crocus sativus L.)又名番红花、藏红花，是一种珍贵的药用植物，用途广泛。其柱头不仅含昂贵的香料和色素，而且含有具有治疗作用的生物活性成分。西红花甙是其中最重要的药用成分。由于西红花基因型的原因，只能用球茎繁殖，产量很低，加上生境要求严格，造成资源短缺和价格昂贵，从而限制了它的开发应用。为了研究西红花药用成分西红花甙的资源，更好地利用西红花甙，本论文开展了西红花甙药理药效、西红花甙生物合成途径关键酶基因的克隆、西红花、近源种分子标记及其遗传转化体系的建立等几个方面的研究。 为建立西红花遗传转化体系，用高压氦气式基因枪将CaMV35S启动子驱动下的gus基因导入西红花的叶、叶鞘和芽来源的愈伤组织块中，48h后染色检测到了gus基因的瞬间表达，20天后仍检测到极少量表达。研究发现，轰击前在加有0.5 mg／L甘露醇的液体愈伤组织继代培养基上处理6h，可以明显增加gus基因表达的数量；选择1100psi×9cm的轰击条件，转化效果最好；高浓度卡那霉素(500mg／L-800 mg／L)可以作为筛选剂。结果表明，基因枪法是有效的西红花遗传转化方法，gus基因可以作为西红花基因工程研究的报告基因，CaMV35S启动子能有效驱动外源基因在西红花组织中表达。这是西红花遗传转化研究的首次报道。 西红花酸合成酶(7，8-二加氧酶)是西红花柱头中西红花甙生物合成途径中的关键酶。根据已发表西红花酸合成酶基因序列设计PCR特异性引物，从西红花柱头总RNA中扩增并克隆到一段长为1.2kb的片段。将该片段连接到pMD18-T载体上。挑选几个克隆测序，结果表明该片段含有两个序列。一个与四川大学博士学位论文已知西红花酸合成酶基因序列高度同源(同源性99%)，命名为乙支充刀。另一个的同源性为96%，命名为称及刃甲鹰矶将比尽犯连接到pB工121质粒上构建成植物表达型载体pBll21一‘污及刃。该工作为研究其在植物中的生物合成能力打下了基础。 为扩大西红花试来源和寻找新的资源，本研究将克隆到的西红花酸合成酶基因心及刃和盘及刃一入百矶分别克隆到表达载体pQE31上，得到重组质粒pQE一31-称及刃和pQE一31一介及刃习论7。重组质粒转化大肠杆菌左coIz’ M15，经IPTG诱导后，表达出了N端融合了6XHis的融合蛋白，其表达量占菌体总蛋白的13.7%和14.4%。SDS一PAGE和western blot分析表明，表达产物的分子量约为49kD和52KD。融合蛋白以包涵体的形式存在，将其变性后经HIS Trap刊HP柱亲和纯化，以期得到蛋白，制备抗体。 按照新药临床前毒理研究规范，通过小鼠和大鼠在不同剂量下先后进行灌服或注射的急性毒性实验和长期毒性实验。结果表明，西红花贰长期用药毒性很小。用西红花贰配制最大浓度0.19/m1，小鼠2鲍体重每日一次灌胃1.Oml;小鼠腹腔注射给药，测定半致死量(LD矽;以SD大鼠分为对照组及西红花贰30Omg、1 00mg、33mg/kg剂量组(分别为人用量的200、66、20倍)，连续灌胃给药三个月，观察西红花贰对动物毒理学各项指标的影响。实验结果表明:小鼠灌服西红花贰的最大耐受量为59/kg，相当于临床用量的500倍;LD匀为2.00549/kg;西红花贰高剂量(300mg/kg)组血液学指标RBC、Hb及HCT显著降低，MCH，MCHc显著升高，恢复期(停药三周)上述指标均在正常范围内，另外两个剂量组血液学RBC、Hb、HCT、MCH及毗HC指标未见异常。西红花贰各组对血液学其它指标、体重、摄食、脑、心、肝、’肾、十二项血清生化指标及心电图等均无明显影响，各脏器大体及镜下检查均未见明显中毒性病理改变。 为观察西红花贰对局灶性脑缺血的治疗作用，用电凝法阻断大鼠脑中动脉，造成局灶性脑缺血模型，十二指肠给药，观察西红花贰对局灶性脑缺血的治疗作用。结果表明，与模型组比较，西红花贰组大鼠脑梗塞灶明显缩小，脑梗塞后动物的神经行为障碍明显减轻，脑指数明显降低，血清SOD活性未见明显改变，MDA含量明显降低，病理学检查表明，脑组织坏死及水肿区域缩小，病变程度明显减轻。西红花贰对局灶性脑缺血有治疗作用。 为观察西红花贰对麻醉犬一般药理学指标的影响。本实验观察了西红花贰对了币犷一四川大学博士学位论文正常麻醉犬呼吸频率、呼吸幅度、动脉血压和心率的影响，实验结果显示，西红花试给药后，对犬动脉血压、心率无明显影响;20mg西红花贰/kg剂量组给药后呼吸频率有所加快，但对呼吸幅度均无明显改变。 为建立高效液相色谱法测定家兔血浆中西红花贰一1浓度的方法，研究西红花贰一l在家兔体内的药代动力学。将家兔jF(注射给药)西红花贰一1后，不同采血点的血浆样品经甲醇沉淀蛋白后，以甲醇一乙睛一l%乙酸(15:10:50)为流动相，采用waterSSpherisorbC，8柱(250咖X4.6nun ID，5阳)分离，流速lmL·min一L，检测波长440nm，柱温25℃。结果表明西红花贰一1浓度在0.86一27.54mg.L一，范围内与峰面积呈良好的线性关系(厂0.9997)，最低检测浓度为0.42mg·L一，。家兔了以注射给药)西红花贰一1后，其药时曲线符合二室模型特征。本方法稳定、简便、可靠，可用于西红花试一1的血药浓度分析及其药代动力学研究。 为对西红花药材?