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研究背景肝细胞癌(Hepatocellular Carcinoma,HCC)是世界范围内最常见高恶性程度的肿瘤之一,它是全球第七位常见肿瘤,是癌症导致死亡的第三位原因。在中国,其致死率更是高居第二位。尽管近年来HCC的治疗取得了长足的进展,但是HCC的总体治疗效果仍相当不理想,其中HCC的复发转移是制约HCC综合治疗效果的十分关键的因素。长期随访发现,在接受根治性切除术后的HCC患者中5年复发率甚至超过70%。因此,阐明HCC发生转移的分子机制,明确HCC发生转移的始动因素,筛选鉴定HCC侵袭转移新靶点,从分子层面对HCC侵袭转移进行诊断或干预有重要的理论和现实意义。近年来,miRNAs作为表观遗传学方式转录后调节器基因的表达式在肿瘤中的功能作用倍受关注,基础研究与临床观察发现miRNAs可能参与包括HCC在内的几乎所有肿瘤的发生发展、治疗转归及预后等各个环节。其中miRNAs可能通过影响肿瘤细胞的运动能力、肿瘤血管生成及肿瘤微环境等参与肿瘤的侵袭转移,尽管miRNAs在HCC中的作用已有所报道,但miRNAs在HCC转移中的作用及其机制仍未完全明了。miR-605-3p是首先在膀胱癌中发现的一种新的miRNA分子,文献报道其在膀胱癌表达明显下调并与膀胱癌的转移密切相关。但miR-605-3p在HCC中的表达模式、功能角色及潜在作用机制尚未见文献报道。故本课题将从细胞和临床组织标本中分析潜在抑癌基因miR-605-3p与HCC侵袭转移的相关性,并通过生物信息学分析结合实验验证探讨miR-605-3p参与HCC侵袭转移的可能分子机制,为进一步探讨HCC侵袭转移的分子信号调控网络、开展以miR-605-3p为靶点研究针对HCC侵袭转移的新的治疗策略提供重要的理论依据。目 的探讨miR-605-3p在HCC组织标本中的表达及临床意义;探讨miR-605-3p模拟物和抑制物分别对HCC细胞株的迁移、侵袭以及HCC细胞株体内转移能力的影响;并深入探讨基于ceRNA模式的SNHG16-miR-605-3p-TRAF6-NF-κκB调控网络在HCC发生发展中的作用机制。方 法(1)实时荧光定量 PCR(Quantitative Real-time PCR,qRT-PCR)、卡方检验、Fisher精确概率法、多元logistic回归分析、Kaplan-Meier生存曲线以及Cox回归模型分析78例HCC患者组织中miR-605-3p的表达以及与临床病理参数及预后的相关性,qRT-PCR分析miR-605-3p在8对发生HCC肝内转移的新鲜组织标本、8对未发生HCC肝内转移的新鲜组织标本中的表达,评估miR-605-3p与HCC肝内转移的关系;(2)qRT-PCR分析miR-605-3p在1株正常肝细胞株(L02)和5株不同转移潜能的肝癌细胞株(HepG2、Hep3B、MHCC97L、MHCC97H、HCCLM3)中的表达;(3)构建miR-605-3p模拟物(miR-605-3p)和抑制物(anti-miR-605-3p)分别转染高表达和低表达miR-605-3p的肝癌细胞株,并且检测转染效率;(4)Transwell基质胶小室实验和细胞划痕愈合实验检测miR-605-3p表达对肝癌细胞迁移与侵袭以及构建肝癌细胞株裸鼠的肺转移模型检测miR-605-3p在活体内对肝癌细胞株转移能力的影响;(5)miR-605-3p和anti-miR-605-3p分别转染高表达和低表达miR-605-3p的肝癌细胞株后,检测上皮间质转化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)表型变化与HCC转移有关的经典信号通路来探索miR-605-3p抑制HCC转移的可能机制,发现miR-605-3p主要参与减弱NF-kB信号通路激活抑制EMT过程从而发挥抑制HCC转移的作用;(6)生物信息学预测可与miR-605-3p相互作用的靶基因,预测miR-605-3p可以和TRAF6的3’UTR结合,通过查阅文献TRAF6是NF-κB信号通路重要的衔接蛋白;(7)qRT-PCR分析临床HCC标本中miR-605-3p和TRAF6表达之间的相关性;(8)双荧光素酶试验验证miR-605-3p可与TRAF6的3’UTR区可以直接结合,qRT-PCR和western blot试验验证miR-605-3p可以在TRAF6转录后水平抑制TRAF6的表达;(9)通过挽救试验验证miR-605-3p是否通过靶向调控TRAF6的表达而影响NF-κB信号通路的激活而发挥抑制HCC转移的作用;(10)通过生物信息学预测可能与miR-605-3p靶基因TRAF6通过内源性竞争miR-605-3p的LncRNAs,在SNHG家族中,通过qRT-PCR检测其在HCC组织标本的表达,发现差异表达最大的LncRNA:SNHG16,从而选取SNHG16作为进一步探索ceRNA参与调控miR-605-3p从而影响HCC转移机制的LncRNA;(11)qRT-PCR分析临床HCC标本中miR-605-3p以及SNHG16表达之间的相关性;(12)核浆分离试验确定SNHG16的表达定位;(13)双荧光素酶试验验证miR-605-3p可与SNHG16可以直接结合,并确定SNHG16和TRAF6 通过内源性竞争 miR-605-3p 的 miRNA 反应元件(miRNA response elements,MREs)发挥ceRNA的功能;(14)Transwell基质胶小室实验和细胞划痕愈合实验检测SNHG16表达对HCC细胞迁移与侵袭能力的影响;(15)通过Western blot检测NF-kB信号通路重要信号蛋白的影响、双荧光素酶报告基因检测NF-κB信号通路的激活、免疫荧光检测NF-κB蛋白的质核穿梭情况来分析SNHG16对NF-κB信号通路的作用;(16)挽救实验验证SNHG16是通过和TRAF6内源性竞争miR-605-3p而发挥促进HCC转移。结 果(1)确定miR-605-3p的表达和HCC的转移潜能呈负相关;(2)证实miR-605-3p可以抑制HCC细胞株在体内体外的转移能力;(3)发现了 miR-605-3p主要是通过抑制NF-κB/p65入核,从而抑制了 NF-kB信号通路介导的EMT,最后抑制了 HCC的转移能力;(3)证实了 SNHG16和TRAF6通过内源性竞争miR-605-3p的方式,从而保护TRAF6免受这些miR-605-3p的抑制作用,最终使TRAF6的表达的水平提高,激活了 NF-κκB信号通路。结 论SNHG16-miR-605-3p-TRAF6-NF-KB调控网络促进NF-κB信号通路激活,因而EMT过程不断发生,使得HCC发生转移。