论文部分内容阅读
皮肤创伤是常见的物理性创伤之一,安全、高效的创伤修复产品具有极大的市场需求。蛋清肽是蛋品精深加工产业中典型的高值化功能性配料,既具有抗氧化、抗炎等与创伤修复密切相关的生理调节功能,又可作为肽和氨基酸补充剂满足创伤修复过程中的营养需求,是极具前景的创伤修复产品开发资源。为确证蛋清肽的创伤修复能力和作用机制,本论文以蛋清肽为研究对象,首先开展蛋清肽的制备鉴定与活性评价,初步明确蛋清肽加速皮肤创伤愈合的潜在能力;随后通过构建小鼠皮肤创伤修复模型,初步评价蛋清肽加速皮肤创伤愈合的修复效果;最后基于转录组-蛋白组联合交互分析,从“基因-蛋白-功能网络”三个维度,深入解析蛋清肽加速皮肤创伤愈合的分子机制。本研究为深度开发蛋清肽创伤修复产品奠定理论基础,为蛋清肽以至食源性生物活性肽的功能挖掘提供新思路。主要研究内容及结论如下:（1）以鲜蛋清为原料,通过碱性蛋白酶酶解制备小分子蛋清肽（150～1k Da）,借助液相色谱-串联质谱与高效液相色谱分别鉴定蛋清肽序列与游离氨基酸组成情况,鉴定得到43条序列长度集中在6～9之间的小分子肽段;蛋清肽中游离氨基酸总量为155.92μg/m L,酶解产物以肽段为主。通过体外化学和细胞实验,证实蛋清肽对自由基和丙二醛（MDA）的清除作用呈浓度依赖性,且安全无毒。通过构建细胞划痕模型与Transwell迁移模型,确证蛋清肽可有效加速皮肤成纤维细胞（HSF）迁移,迁移速度与蛋清肽浓度呈正相关,高剂量蛋清肽（5 mg/m L）干预48 h后,细胞迁移率较对照组提升3倍。（2）构建小鼠皮肤创伤修复模型,追踪蛋清肽灌胃干预后3、7、14天的创面组织伤口愈合率、病理表征、炎症因子和生长因子分泌情况、血清氧化损伤指标、血清氨基酸补充情况等,综合评价蛋清肽的创伤修复效果。高剂量蛋清肽（400mg/kg）干预未造成脏器损伤,13天后创伤愈合率高达90%。蛋清肽干预后,小鼠血清氨基酸（特别是Arg、Glu、Pro、Met和Lys）含量增加,且呈浓度依赖性。蛋清肽通过增强血清过氧化氢酶（CAT）和超氧化物歧化酶（SOD）活性并降低MDA含量,有效抑制了机体氧化应激反应;通过抑制炎症因子白细胞介素（IL）-6、IL-8、IL-1β及肿瘤坏死因子（TNF-α）分泌,同时激活髓过氧化物酶（MPO）分泌,加速中性粒细胞清除炎症,进而缩短炎症周期;通过抑制单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）分泌,同时促进血小板衍生生长因子（PDGF）、血管内皮细胞生长因子（VEGF）和转化生长因子β1（TGF-β1）分泌,加速炎症后期（特别是增殖期）创面肉芽组织及内皮的新生,进而加速皮肤创伤愈合。（3）基于Illumina hiseq测序平台开展转录组学研究。RNA-seq测序数据显示,各样本碱基错误率均96.90%,Q30>91.00%,Total mapped>91.00%,满足分析要求。各组皮肤组织m RNA表达结果显示,造模14天后模型组（M）相比空白对照组（CK）上、下调差异基因（DEGs）分别为3,949、3,790,蛋清肽干预组（H）相比M组上、下调DEGs分别为127、591,差异极显著的基因数为174（p<0.01）。显著差异基因集HZ＿174的KEGG功能注释表明,上调通路主要为遗传信息处理相关通路,下调通路主要为生物体系统、遗传信息处理以及人类疾病相关通路。KEGG功能富集和DEGs对应蛋白互作分析结果表明,蛋清肽通过显著下调基因Cd200r1、Lilrb4a、Pira2、Ccl7、Clec4d、Cd200r4、Pik3cg、Tlr1、Il7r、Clec4n、Ptgs2、Lyn（p<0.05）,参与调控炎症调节通路map04060、map04062、map04662、map04668、map04657及创面组织再生通路PI3K-AKT,加速创伤愈合进程。（4）利用TMT蛋白质组学技术,从9个皮肤样本中鉴定出72,967条多肽与8,075种蛋白。Venn分析结果显示,M组与CK组相比,差异蛋白（DEPs）高达3,337,说明模型构建显著影响了样本蛋白表达情况。此外,H组相比M组,DEPs上、下调分别为38、17,H组相比CK、M共有的上、下调DEPs数分别为12、4。全蛋白KEGG功能注释结果表明,上述DEPs主要参与氨基酸代谢与合成、炎症调节及病毒感染等通路。WB验证实验表明,PI3K、Lyn、MMP9、COX2、AKT、VEGFR2等关键DEPs表达量与转录组相关基因表达量的上下调、TMT数据以及皮肤组织生长因子表达趋势一致。转录组-蛋白组联合分析显示,有24个共有基因与其蛋白表达相一致,其中PI3K-AKT通路相关的DEGs和DEPs表达趋势高度一致,PI3K-AKT通路在创伤愈合过程中发挥着关键性作用,PI3K-AKT通路与黏附斑信号通路、Ras信号通路、MAPK通路以及ECM-受体相互作用通路互作,构成了以PI3K-AKT为核心的创伤修复功能网络。