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类风湿关节炎（RA）是一种以滑膜组织发生炎症性变化为主的系统性、自身免疫性疾病,发病机制复杂,尚未完全阐明。早期人们对RA致病机制的认识主要集中于以CD4+T细胞即T辅助细胞（Th）为主的免疫优势格局上,但随着B淋巴细胞靶向药物利妥昔单抗在抗RA治疗中所取得的成功,B淋巴细胞在RA致病机制中的重要作用也逐渐突显。B细胞主要通过介导体液免疫参与免疫的调节,根据T细胞的参与与否,可以分为T细胞依赖性（TD）和非依赖性（TI）体液免疫两种类型。课题组前期在关于钩吻生物碱单体钩吻素子抗RA作用的研究中发现,钩吻素子可显著抑制Ⅱ型胶原诱导关节炎（CIA）大鼠血清抗Ⅱ型胶原自身抗体IgG水平的升高,提示钩吻素子对B细胞介导的体液免疫可能具有调节作用,但具体的作用及作用机制尚未明确。本文分别在离体细胞水平和整体动物水平建立TI和TD样B淋巴细胞活化研究模型,探讨钩吻素子对B淋巴细胞的免疫调节作用和作用特点,以期较为全面阐明钩吻素子抗RA作用机制,为其在RA治疗中的应用提供科学依据。1钩吻素子对原代培养B淋巴细胞TI和TD样活化及增殖、分化和免疫球蛋白分泌的抑制作用以免疫磁珠分选获得小鼠原代B淋巴细胞为研究对象,分别用脂多糖（LPS）和抗CD40抗体诱导建立TI和TD活化模型,在此基础上给予不同浓度钩吻素子（10、40、70μmol/L）,以5-溴-2-脱氧尿嘧啶核苷（Brd U）掺入法检测细胞增殖情况,以细胞表面CD69、CD86为早期活化和活化标识,CD138为分化标识,采用流式细胞术检测细胞相对数量,以LEGENDplex TM法检测细胞培养上清中免疫球蛋白的相对含量,观察分析钩吻素子对TI和TD样B淋巴细胞活化、增殖、分化及免疫球蛋白分泌的影响。结果发现,给予LPS或抗CD40抗体诱导,均可引起B细胞群中CD69+与CD86+细胞比例显著升高,提示成功建立B淋巴细胞的离体水平TI样和TD样活化模型,其中TI模型的活化、增殖效应较TD模型弱,但分化和抗体分泌反应较TD为强。钩吻素子对LPS诱导的B淋巴细胞活化、增殖不产生显著性作用,但可呈浓度依赖性抑制其分化及IgM、IgG2b和IgG3的分泌;在抗CD40抗体诱导的TD模型中,钩吻素子可呈浓度依赖性抑制B淋巴细胞的活化、增殖,对细胞分化不产生显著性作用,对模型组细胞IgM的分泌具有浓度依赖性抑制作用。2钩吻素子对TI和TD体液免疫应答的调节作用2.1钩吻素子对TI体液免疫反应的调节作用以8-10周龄C57BL/6J小鼠为对象,以经典的TI抗原NP-AECM-FICOLL诱导建立TI体液免疫模型,观察钩吻素子对模型血清总抗体IgM、IgG3和NP特异性抗体NP-IgM、NP-IgG3水平的影响。动物分为对照组、体液免疫模型组以及模型鼠钩吻素子处理组（0.4、2和10 mg/kg）。在小鼠单次腹腔注射100μg NP-AECM-FICOLL建立模型,分别于实验当日（D0）注射前1 h和注射后第1-6天灌胃给予钩吻素子,每天1次,连续7天（D0-6）。于最后一次给药后1 h处死动物,制备小鼠全血血清,以ELISA法检测抗体水平。结果发现,在NP-AECM-FICOLL引起的TI免疫应答中,钩吻素子对模型鼠血清总IgM、IgG3不产生显著性影响,但对模型鼠NP特异性抗体NP-IgM和NP-IgG3水平的升高具有显著抑制效应,作用呈剂量依赖性。2.2钩吻素子对TD体液免疫的调节作用2.2.1钩吻素子对TD体液免疫初次应答的调节作用以8-10周龄C57BL/6J小鼠为对象,以经典的TD抗原NP-CGG诱导建立TD体液免疫初次应答模型,观察钩吻素子对模型血清总抗体IgM、IgG1和NP特异性抗体NP-IgM、NP-IgG1水平的影响。动物分为对照组、体液免疫模型组以及模型鼠钩吻素子处理组（0.4、2和10 mg/kg）。以单次腹腔注射100μg NP-CGG/Alum的方式建模,免疫后第4天开始灌胃给予钩吻素子,每天1次,连续10天。于最后一次给药后1 h,制备血清,以ELISA法检测相应抗体。结果发现,2 mg/kg钩吻素子处理组血清总IgM水平以及0.4 mg/kg钩吻素子处理组总IgG1水平显著低于模型组,而对模型鼠NP-IgG1水平的升高,钩吻素子则表现为剂量依赖性抑制作用。2.2.2钩吻素子对TD体液免疫再次应答的调节作用以C57BL/6J小鼠为对象,以NP-CGG诱导建立TD体液免疫再次应答模型。动物分为对照组、体液免疫模型组以及模型鼠钩吻素子处理组（0.4、2和10 mg/kg）。在小鼠腹腔注射50μg NP-CGG/Alum建立模型,初次免疫5天后开始灌胃给予钩吻素子,每天1次,持续10天;初次免疫10天后（D9）进行二次免疫,腹腔注射50μg NP-CGG/Alum。于最后一次给药后1 h处死动物,取小鼠脾细胞,流式细胞术检测生发中心（GC）B细胞（GL7+FAS+of B220+）和IgG1+GC B细胞（IgG1+IgM-of GL7+FAS+B220+）的比例;取小鼠血清,而后以ELISA检测相应的抗体。结果发现,钩吻素子对模型鼠血清总IgM和IgG1及NP-IgG3不产生显著抑制效应,但可呈剂量依赖性抑制模型组NP-IgM水平的升高,同时对模型组脾脏GC的形成以及B细胞的生存和发育不产生显著抑制作用。上述结果提示,钩吻素子对活化的B淋巴细胞具有直接与间接的免疫调节作用,表现为可直接抑制B细胞异常活化后的分化及自身抗体分泌,也可间接抑制T细胞依赖的B淋巴细胞的活化和增殖从而减少抗体的分泌,这可能是其抗RA的重要作用方式之一。钩吻素子对T细胞依赖性及非依赖性体液免疫均具有调节作用,可使B淋巴细胞异常活化介导的免疫反应趋向于正常化,减轻自身抗体过度分泌引起的机体损伤,且对B淋巴细胞的生存、发育以及GC的形成不产生显著影响。