论文部分内容阅读
嗜酸真菌Bispora sp. MEY-1分离自江西金属矿废水,具有极端嗜酸性,最适生长的pH为2.5-3.0,可分泌产生多种重要的工业用酶,包括β-葡聚糖酶、木聚糖酶、果胶酶、β-甘露聚糖酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、淀粉酶、CMCase以及β-葡萄糖苷酶等九种糖苷水解酶,是一株优良的工业产酶菌。本文从嗜酸真菌Bispora sp. MEY-1分离克隆到3个糖苷水解酶基因,即β-1,3-1,4-葡聚糖酶bgl7A、木聚糖酶xylD和多聚半乳糖醛酸酶pga1。对三个基因进行了序列分析,并进行了三维结构的预测。它们的氨基酸序列同已知序列一致性在50–68%之间,具有较高的新颖性。将这三个基因在毕赤酵母中进行表达,并对重组酶进行了纯化和性质测定。β-1,3-1,4-葡聚糖酶BGL7A与来源于Aspergillus terreus的假定第七家族内切葡聚糖酶EG-1氨基酸序列具有最高一致性（59.5%）。BGL7A的最适pH值有三个峰值分别是pH 1.5、3.5和5.0,其中pH 5.0为最高值,最适温度为60°C,在pH 1.0–8.0之间和60°C分别处理60 min酶的稳定性良好。以大麦葡聚糖为底物测得Km和Vmax分别是9.16 mg/ml和6,737μmol/min/mg。以大麦葡聚糖和地衣多糖为底物分析BGL7A的比活分别为4,040和2,740 U/mg,高于CMC-Na的比活395 U/mg,这一点不同于其他已报道的第七家族内切葡聚糖酶。木聚糖酶XYLD与来源于Talaromyces stipitatus的假定内切-1,6-β-D-葡聚糖酶氨基酸序列具有最高一致性（49.9%）,与来源于Leptosphaeria maculans的假定木聚糖酶的序列一致性为38.8%,但经性质研究发现其只具有木聚糖酶活性,不具有葡聚糖酶活性,经分析确定其为第30家族的木聚糖酶。最适pH值为3.0,最适温度为60°C,pH 1.0–6.0之间和温度60°C下分别处理60 min稳定性良好。XYLD以山毛榉木聚糖、桦木木聚糖、4-O-甲基-D-葡糖醛酸木聚糖和燕麦木聚糖为底物的比活分别是2,463、2,144、2,020和1,429 U/mg。以山毛榉木聚糖为底物分析表观Km和Vmax分别是5.6 mg/ml和3,622μmol/min/mg。多聚半乳糖醛酸酶PGA1与来源于Colletotrichum lupini的内切多聚半乳糖醛酸酶氨基酸序列具有最高一致性（67.2%）。最适pH和最适温度分别为3.5和55°C。在pH 2.0–7.0之间和60°C下稳定性良好。PGA1以多聚半乳糖醛酸和果胶为底物的比活分别为1,520和725 U/mg。以多聚半乳糖醛酸为底物分析表观Km和Vmax分别为1.25 mg/ml和2,526μmol/min/mg。用10 U/mL的PGA1处理苹果汁,可使苹果汁的粘度降低7.7%,而透光率增加84%。结果表明,酸性条件下PGA1具有良好工业应用潜力。本实验中克隆到的三个酶都是嗜酸酶,在饲料、食品等领域有广阔的应用前景。