牛乳是由母奶牛乳腺分泌出的一种具有胶体特性，含有幼畜生长发育所必需的全部营养成分的均匀生物学液体，具有较高的营养价值，其中含有许多促进人类生长发育及维持健康水平所必需的营养成分。乳蛋白是乳营养中最重要部分之一，乳蛋白含量已经成为现在许多牛乳收购计价系统的基础物质之一。由于乳及乳制品中蛋白含量较高且相对固定。因此，向乳中添加其它蛋白如动物蛋白、植物蛋白来代替乳蛋白，增加乳中蛋白含量，已经成为现在中国牛乳掺假的重要手段。掺假乳不但降低了乳产品营养价值，严重的还会导致食物的安全问题，直接影响了奶农、生产厂家和消费者的利益。现有的各种掺假检测方法都存在一定的局限性，很多只适合于在实验室内使用，需要复杂的样品处理过程和昂贵的药品、设备，还不能应用于实践当中；有些只能对特定掺假物进行检测，其它一些掺假物可能会对此检测方法有影响；有些需要时间过长，不利于现场检测。为此，本文结合牛乳验收过程中存在的实际问题，建立牛乳掺假的检测方法。本试验通过近一年的研究，分别开发了比色法、离子交换色谱-积分脉冲安培法(anionic exchange chromatograph-integral pulse ampere determination，HPEAC-IPAD，1和2，4-二硝基氟苯(2，4-dinitro fluorobenzene，DNFB，)柱前衍生高效液相色谱法用于检测牛乳中掺加的水解胶原蛋白。1．比色法检测牛乳中掺加的胶原水解蛋白在胶原的羟脯氨酸(hydroxyproline，Hyp)测定中，传统的酸法水解是在110℃下使用6mol／L的HCl消解24h，其操作步骤繁琐且所花时间较长。通过旋转回归设计对酸水解条件的优化，简化Hyp测定的操作步骤，缩短酸水解时间。HCl浓度，水解时间和反应温度对Hyp的测定具有显著影响。酸法水解测定Hyp的优化条件为：HCl浓度11.6mol／L，水解温度为110℃，水解时间6h。使用优化后的条件测定Hyp缩短了测定时间，简化了操作，而且灵敏度和重复性较好，可用于快速测定胶原水解蛋白中的Hyp含量。胶原水解蛋白中含有高比例的Hyp，采用分光光度计比色法首先测定Hyp的含量，由测得的Hyp量乘以7.93即可得出乳中掺加的动物胶原水解蛋白的量。该方法的准确度和重复性均较好。此方法所用仪器操作简便、经济，且操作方法步骤简单。采用优化后的水解条件来水解动物胶原水解蛋白，可大大缩短水解时间，可以快速的检测牛乳中掺加的动物胶原水解蛋白(＜7h)。该方法的检出限为9.00μg／mL。掺加1％的胶原水解蛋白就可以检测得到。此方法是目前最常采用的方法之一，但是它在检测精度方面与HPLC法相比有很大的不足。该法适合于在企业实验室使用。2．离子交换色谱-积分脉冲安培法检测牛乳中掺加的胶原水解蛋白本研究采用阴离子交换色谱-积分脉冲安培法检测牛乳中掺加的动物胶原水解蛋白。由于胶原水解蛋白中含有高比例的羟脯氨酸，由测得的羟脯氨酸含量乘以7.65得到牛乳中掺加的胶原水解蛋白量。该法无需衍生处理，可直接对羟脯氨酸进行测定。以AminoPac PA10为色谱柱，流动相A：超纯水(＞18.2Ω)，流动相B：0.25mol／L的NaOH，流动相C：1.0mol／L的NaAC。采用离子交换色谱-积分脉冲安培法测定牛乳中掺加的胶原水解蛋白，当Hyp在20～200nmol／L时具有良好的线性关系。结果表明该法具有较好的稳定性(RSD小于3％)和较高的回收率(89.16％～100.48％)。此法的检出限为1.0μg／mL。检测精度高。分析可在42min内完成。3．2，4-二硝基氟苯柱前衍生反相高效液相法检测牛乳中掺加的胶原水解蛋白本试验采用2，4-二硝基氟苯(DNFB)柱前衍生高效液相色谱法检测牛乳中掺加的胶原水解蛋白。由于胶原水解蛋白中含有高比例的Hyp，由测得的羟脯氨酸的含量乘以7.73可以得到牛乳中掺加的胶原水解蛋白的量。本试验以symmetry-C18(150mm×3.9mm，i．d．5μm)为色谱柱，2，4-二硝基氟苯为衍生试剂，梯度洗脱。流动相A：0.05mol／L乙酸钠缓冲溶液(pH=6.5，含10mL／L四氢呋喃)，流动相B：乙腈—水(体积比1：1)。Hyp在2～10μg／mL时与峰面积具有良好的线性关系。该法的准确度(93.47％～101.20％)和精密度(RSD=1.62)较好。最低检出限为2.5μg／mL。分析可在15min内完成。检测精度较高。