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第一章神经酰胺介导高浓度D-葡萄糖诱导的人脐静脉内皮细胞凋亡目的观察高浓度D-葡萄糖对人脐静脉内皮细胞(human umbilical veinendothelial cells,HUVECs)凋亡及细胞神经酰胺(ceramide,CER)和酸性鞘磷脂酶(acid sphingomyelinase,A-Smase)的影响,初步探讨神经酰胺信号通路是否参与高浓度D-葡萄糖诱导的血管内皮细胞凋亡。方法①细胞膜和细胞内神经酰胺的测定:HUVECs分别在5mM或30mM D-葡萄糖条件下培养不同时间(4、8、12、16、24h),分别在梯度浓度D-葡萄糖(5、10、20、30mM)、30mM D-葡萄糖+2μM酸性鞘磷脂酶抑制剂地昔帕明、25mM L-葡萄糖条件下培养16h,以高压液相色谱串联质谱法(liquid chromatography/ion spray ionizationtandem mass spectrometry,LC/MS/MS)检测细胞膜和细胞内神经酰胺的变化。②细胞内酸性鞘磷脂酶活性的检测:HUVECs分别在5mM或30mM D-葡萄糖条件下培养不同时间(0.5、1、2、4、8、12h),分别在梯度浓度D-葡萄糖(5、10、20、30mM)、30mM D-葡萄糖+2μM地昔帕明、25mM L-葡萄糖条件下培养2h,以荧光底物BODIPYC12-sphingomyelin(B12-SPM)和高压液相色谱法(high-performanceliquid chromatography,HPLC)检测细胞内酸性鞘磷脂酶活性。③HUVECs分别在5mM或30mM D-葡萄糖、30mM D-葡萄糖+2μM地昔帕明、30mM D-葡萄糖+2μM地昔帕明+50μM外源性C2-神经酰胺(C2-ceramide,C2-CER)及25mM L-葡萄糖条件下培养24、48h,以Annexin-FITC/PI双染流式细胞术和TUNEL法检测细胞凋亡。④HUVECs分别在不同浓度外源性C2-CER(25、50μM)及A-Smase(0.01、0.1、1U/ml)条件下培养24、48h,以Annexin-FITC/PI双染流式细胞术和TUNEL法检测细胞凋亡。结果①高浓度D-葡萄糖呈浓度依赖性引起细胞内神经酰胺显著升高,以16h最明显(P＜0.01);细胞膜神经酰胺浓度无明显变化。②高浓度D-葡萄糖呈浓度依赖性引起细胞内酸性鞘磷脂酶活性升高,以2h最明显(P＜0.01)。③高浓度D-葡萄糖诱导的细胞内神经酰胺和酸性鞘磷脂酶变化均可被酸性鞘磷脂酶抑制剂地昔帕明抑制(P＜0.05);高浓度L-葡萄糖对神经酰胺和酸性鞘磷脂酶均无影响。④48h时高浓度D-葡萄糖可明显增加内皮细胞凋亡率,地昔帕明可抑制高浓度D-葡萄糖诱导的内皮细胞凋亡,外源性CER可逆转这一抑制作用(P＜0.05);高浓度L-葡萄糖对内皮细胞凋亡无影响。⑤细胞内神经酰胺增加与D-葡萄糖浓度显著正相关(P=0.000);细胞内神经酰胺增加与高浓度D-葡萄糖诱导的内皮细胞凋亡增加显著正相关(P=0.000)。⑥48h时50μM C2-CER及1U/ml A-Smase可明显增加内皮细胞凋亡率(P＜0.05)。结论由酸性鞘磷脂酶水解引起的细胞内神经酰胺增加参与了高浓度D-葡萄糖诱导的人脐静脉内皮细胞凋亡。第二章JNK/SAPK信号转导途径在神经酰胺下游启动引起细胞凋亡目的观察高浓度D-葡萄糖和外源性神经酰胺对p-JNK、p-c-Jun、bax、bcl-2的影响,了解JNK/SAPK信号转导途径是否在神经酰胺的下游启动,介导高浓度D-葡萄糖诱导的人脐静脉内皮细胞凋亡。方法①HUVECs分别在5mM或30mM D-葡萄糖、30mM D-葡萄糖+25μM SP600125、50μM C2-CER+25μM SP600125(JNK抑制剂)条件下培养48h,以Annexin-FITC/PI双染流式细胞术和TUNEL法检测细胞凋亡。②HUVECs分别在5mM或30mM D-葡萄糖、50μM C2-CER条件下培养6,12,24h,在30mM D-葡萄糖+2μM地昔帕明条件下培养12h,以Western Blot测定p-JNK、p-c-Jun蛋白表达水平。③HUVECs分别在5mM或30mM D-葡萄糖、50μM C2-CER条件下培养6,12,24h,在30mM D-葡萄糖+2μM地昔帕明、30mM D-葡萄糖+25μM SP600125、50μM C2-CER+25μM SP600125条件下培养24h,以Western Blot测定bax、bcl-2蛋白表达水平。④HUVECs分别在5mM或30mM D-葡萄糖、30mM D-葡萄糖+25μM SP600125条件下培养16h,以LC/MS/MS法检测细胞内神经酰胺的变化。⑤HUVECs分别在5mM或30mM D-葡萄糖、30mM D-葡萄糖+25μM SP600125条件下培养2h,以荧光底物B12-SPM和HPLC检测细胞内酸性鞘磷脂酶活性。结果①JNK特异性阻断剂SP600125可抑制高浓度D-葡萄糖和外源性神经酰胺诱导的血管内皮细胞凋亡(P＜0.05)。②高浓度D-葡萄糖和外源性神经酰胺可上调p-JNK、p-c-Jun蛋白表达水平,以12h最明显(P＜0.05);高浓度D-葡萄糖的作用可被酸性鞘磷脂酶抑制剂地昔帕明抑制(P＜0.05)。③高浓度D-葡萄糖和外源性神经酰胺可上调bax蛋白表达水平,以24h最明显(P＜0.05);SP600125可抑制高浓度D-葡萄糖和外源性神经酰胺的这一作用(P＜0.05);地昔帕明可抑制高浓度D-葡萄糖引起的bax蛋白表达增加(P＜0.05)。④高浓度D-葡萄糖和外源性神经酰胺可下调bcl-2蛋白表达水平,以24h最明显(P＜0.05);SP600125可抑制高浓度D-葡萄糖和外源性神经酰胺的这一作用(P＜0.05);地昔帕明可抑制高浓度D-葡萄糖引起的bcl-2蛋白表达减少(P＜0.05)。⑤SP600125对高浓度D-葡萄糖诱导的酸性鞘磷脂酶活化和细胞内神经酰胺增加无明显影响。结论JNK/SAPK信号转导途径在神经酰胺下游启动,高浓度D-葡萄糖诱导血管内皮细胞的凋亡机制中,存在“高浓度D-葡萄糖刺激—神经酰胺产生增加—JNK/SAPK激活—bax和bcl-2表达变化—细胞凋亡”这一级联反应。第三章吡格列酮对高浓度D-葡萄糖诱导的人脐静脉内皮细胞凋亡的影响及作用机制目的观察吡格列酮对高浓度D-葡萄糖诱导的人脐静脉内皮细胞凋亡的影响并探讨其神经酰胺作用机制。方法①HUVECs分别在5mM或30mM D-葡萄糖,30mM D-葡萄糖+不同浓度吡格列酮(0.1、1、10μM),30mM D-葡萄糖+10μM吡格列酮+50μM外源性神经酰胺(C2-CER)及30mM D-葡萄糖+10μM吡格列酮+1U/ml外源性酸性鞘磷脂酶(A-Smase)条件下培养48h,以Annexin-FITC/PI双染流式细胞术和TUNEL法检测细胞凋亡。②HUVECs分别在5mM或30mM D-葡萄糖,30mM D-葡萄糖+不同浓度吡格列酮(0.1、1、10μM)条件下培养2h,以荧光底物B12-SPM和HPLC检测细胞内酸性鞘磷脂酶活性。③HUVECs分别在5mM或30mM D-葡萄糖,30mM D-葡萄糖+不同浓度吡格列酮(0.1、1、10μM)条件下培养16h,以LC/MS/MS法检测细胞内神经酰胺的变化。结果①高浓度D-葡萄糖明显增加内皮细胞凋亡率,吡格列酮可呈浓度依赖性抑制高浓度D-葡萄糖诱导的内皮细胞凋亡(P＜0.05),这一抑制作用可被外源性神经酰胺和酸性鞘磷脂酶逆转(P＜0.05)。②高浓度D-葡萄糖可引起细胞内酸性鞘磷脂酶活性和神经酰胺明显升高,吡格列酮对细胞内酸性鞘磷脂酶活化及神经酰胺产生都具有抑制作用(P＜0.05)。结论吡格列酮可抑制高浓度D-葡萄糖诱导的人脐静脉内皮细胞凋亡,这一保护作用与其抑制高浓度D-葡萄糖诱导的细胞内酸性鞘磷脂酶的活性升高,减少细胞内神经酰胺的产生相关。