拟南芥突变体dg1抑制子的筛选与功能研究

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叶绿体的基因表达对叶绿体发育具有重要作用,它的表达过程受各种核基因编码因子的调控,其中很大一类是PPR蛋白。本实验室在拟南芥中发现了一个影响叶绿体早期发育的PPR蛋白DG1,它是一个含798个氨基酸的多肽,大小为92 kD,有8个PPR结构域。虽然之前的研究已经证实了DG1蛋白调控PEP依赖的叶绿体基因的转录调节过程,影响拟南芥叶绿体早期发育阶段的调节过程,但DG1蛋白的具体作用方式现在还不清楚。筛选拟南芥突变体dg1抑制子可能会发现一些与叶绿体基因表达相关的基因,有助于我们更好地了解叶绿体基因的表达调控过程。  dg1突变体的幼叶有明显的黄化表型,并且表现出高荧光。本研究通过EMS(Sulfonic acid ethylester)诱变的方法对dg1进行诱变构建了突变体库,从突变体库中我们筛选到了dg1突变体抑制子的12个株系,并对其中两个株系(sup1和sup2)进行了相关研究。  首先对sup1和sup2进行了光合蛋白表达分析,发现sup1中光合蛋白的表达水平跟dg1相比上升了,基本恢复为野生型水平,而在sup2突变体中光系统蛋白含量没有变化。对sup1和sup2的光合基因表达分析发现,它们跟dg1相比PEP聚合酶转录的基因(PsbB、PsbC、PsbD、PsbE、PsbF)的表达水平上升,NEP聚合酶转录的基因(accD、ycf2、rpoB)的表达水平下降,PEP和NEP聚合酶共同转录的基因(atpl、clpp、ndhB的表达水平也有所变化,其中atpl的表达水平上升,clpp、ndhB表达水平下降。但是这些基因的表达水平都更接近于野生型水平,这说明sup1和sup2的光合基因表达水平恢复了。  将sup1和sup2分别与dg1回交,得到的F1代为dg1表型,这说明sup1和sup2为隐性突变;将sup1和sup2分别与野生型(Col)杂交,得到的F1代为野生型表型,F1代自交得到的F2代表型分离,野生型:dg1: sup的分离比为12∶ 3∶1。这些结果表明sup1和sup2是dg1背景的单基因控制的隐性突变。接着又用图位克隆和二代测序的方法找到了一些候选基因,sup1的候选基因为AT2G24300,sup2的候选基因为SDG1,把这些候选基因的CDS序列连到双元载体上,用农杆菌侵染的方法向拟南芥dg1抑制子植株中进行转基因,结果sup1的表型没有得到互补,sup2的表型互补成功,叶色和荧光值(Fv/Fm)都接近于dg1。这说明SDG1基因是使sup2的表型得到回复的基因。  sup2的突变基因SDG1编码一个SDG1蛋白,定位于叶绿体被膜,对于它的功能我们还不清楚。通过对sup2表型的分析,我们对该蛋白的功能进行了一些猜测。sup2的叶色发黄,叶绿素含量减少,所以SDG1蛋白可能参与叶绿素的合成或者核基因编码的叶绿体蛋白的转运。在dg1背景下,SDG1蛋白的缺失可能引起LHCII功能的改变,PSII捕获光能的能力减弱,光能吸收和传递之间达到一个新的平衡,从而使dg1的Fv/Fm恢复到野生型水平,对于SDG1蛋白的具体功能还需进一步的深入研究。
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