论文部分内容阅读
本研究所用纤溶酶ZLW-2来源于保定市屠宰场土壤里筛选出的芽孢杆菌ZLW-2,具有强烈的溶解血栓的作用,可作为一种治疗心脑血管疾病新型药物予以开发。本文利用基因克隆技术,分离得到该酶的全长DNA序列,并提交GeneBank,登录号为EU734749。序列分析表明,Bacillus sp.ZLW-2纤溶酶基因全长1146 bp,包含一个完整编码阅读框,编码381个氨基酸,理论分子量为39.358KD。经signalP3.0分析,在29个氨基酸A前为信号肽序列(signal peptide),后面是一段77个氨基酸残基组成的前导肽(propeptide)和275个氨基酸残基的成熟肽(mature peptide)。本序列在GeneBank中BLAST比对,结果发现,此酶核苷酸序列与日本发现的纳豆激酶NK和纳豆激酶AY210091同源性达99%,而且此酶具有和纳豆激酶相同的活性中心Asp32,His64 and Ser221和底物结合中心Ser125,Leu64和Gly127,属于丝氨酸蛋白酶。因此可以初步认定此纤溶酶即为纳豆激酶。根据已测序的纤溶酶EU734749基因序列及原核表达载体pET28a的性质,设计引物分别扩增包括信号肽,前导肽和成熟肽的前纤溶酶原(NK1)序列,包括前导肽和成熟肽的纤溶酶原(NK2)片段以及只包括成熟肽的纤溶酶(NK3)片段,并将其分别连接到表达载体pET28a转化大肠杆菌BL21中进行诱导表达。结果表明,三种重组质粒均具有良好的遗传稳定性,传代100代后重组质粒仍稳定存在。其中重组质粒pET28a-NK2和pET28a-NK3的工程菌株经诱导后并没有发现酶活,产物经超声波破碎和包涵体变性复性后依然没有检测到纤溶酶活。而含有前纤溶酶原基因NK1的工程菌在30℃,0.1mmol/L IPTG诱导20h后的表达产物经-80℃反复冻融后酶活可达183U/mL。为了进一步提高外源基因的稳定性及表达量,将纤溶酶原基因pro-nk,nk克隆到毕赤酵母中进行研究。根据所获得的基因序列EU734749和真核表达载体pPIC9K的性质重新设计引物,构建重组质粒pPIC9K-pro-nk,pPIC9K-nk。将重组质粒线性化后,电转化毕赤酵母GS115,MD,MM快慢型和酶活透明圈初筛,通过检测重组酵母发酵上清液中的纤溶酶活性复筛得到一株外源蛋白产量较高的重组酵母PK53。通过对PK53的生长规律和发酵条件的研究发现,外源基因的稳定性很好,即使在没有选择压力存在下,繁殖10代后,其外源基因的丢失率仍为零。在30℃,250 rpm培养条件下,优化其它发酵条件,当发酵接种量1 %,装液量为40 mL /300mL,甲醇添加量为0.7%时,重组酵母的产酶活力可达675.53 U/mL,是出发菌株酶活力的4.99倍。该酶最适作用温度为50℃,酶的最适作用pH为8.0。与出发菌株酶学性质一致,表明真核表达对其酶学性质并没有造成影响。