高盐摄入通过SGLT2调控血糖稳态的机制

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背景和目的:糖尿病患者的高血压管理是降低心血管死亡率和发病率的关键。长期以来,高血压的饮食调节方案重点关注在食盐摄入上。因此各大指南推荐糖尿病合并高血压患者限制盐的摄入。然而,限盐的潜在效益仍存有争议,一些证据显示,限盐会增加糖尿病合并高血压患者的心血管及全因死亡率,且高糖饮食对升高血压的影响远远大于高盐摄入。然而,关于盐摄入与血糖稳态之间的紧密联系的研究仍缺乏,人们对此知之甚少。人体肾脏可调节体液和电解质的平衡,同时对葡萄糖的过滤和重吸收起着至关重要的作用。其中,分布在肾脏皮质近端小管上皮细胞管腔侧的钠-葡萄糖协同转运蛋白(SGLTs),具有调节钠、糖重吸收的功能,能以较高效率以1:1协同转运Na+和葡萄糖。在高糖状态下,SGLT2的活性增加,对葡萄糖和钠的重吸收增强。而在糖尿病大鼠动物模型中,SGLT2突变可防止高糖诱导的多器官功能损害。选择性SGLT2抑制剂可改善糖尿病患者的高血糖,并有呈现出轻微的降压作用。近10年来,过氧化物酶体增殖物激活受体(peroxisome proliferator-activated receptor,PPAR)已经成为心血管代谢疾病的新型有效治疗靶点。人类肾脏表达不同的三种PPAR亚型,PPARα,PPARγ和PPARδ,在机体的糖脂代谢中发挥了重要作用。现今糖尿病治疗用噻唑烷二酮类(TZD)药物,就是通过激活脂肪组织PPARγ改善胰岛素抵抗,从而发挥改善血糖的作用。然而,研究表明TZD类药物可能导致水钠潴留及心衰,大大限制了其临床应用。PPARδ在几乎所有的细胞与组织中均存在表达,被认为参与了许多慢性病的发病过程,包括高血压、糖尿病、粥样硬化以及肥胖等,其特异性激动剂或基因表达上调均可有效缓解肥胖伴糖尿病啮齿类动物的高血脂、血糖和胰岛素抵抗。在糖尿病大鼠中,特异性激动PPARδ表达后表现出肾脏保护作用。此外,PPARδ激动剂增加的脂肪脂联素的表达,可在心血管疾病中发挥有益作用。然而,目前尚不清楚PPARδ是否通过调节脂联素表达参与了肾脏对钠的处置以及对葡萄糖的转运。脂联素是脂肪组织尤其是内脏脂肪组织分泌最丰富的蛋白质产物。脂联素通过其特异性受体,AdipoR1和AdipoR2,在多种组织和细胞中发挥其生理功能。已有研究发现PPARs在脂联素的表达调控中发挥了重要作用。应用PPARδ激动剂可显著升高内脏脂肪脂联素的表达水平,从而发挥改善心血管代谢紊乱的综合效应。血清脂联素水平在多种代谢性心血管疾病中降低,同时低脂联素水平可能是胰岛素抵抗发生、发展的重要原因。摄盐量对脂联素分泌有重要作用,低盐干预可显著上调脂肪组织脂联素分泌,同时改善胰岛素抵抗以及全身炎症反应。但脂联素如何参与盐的代谢尚不明确。在本研究中,我们提出PPARδ通过调节脂联素表达参与了肾小管SGLT2对钠的转运和葡萄糖的重吸收过程,干预该环节中的一个或多个关键靶点可维持或恢复钠和葡萄糖稳态的科学假设,并开展了一系列的细胞、动物实验及临床验证,为了验证上述假设,本研究分为两部分进行:1、验证高盐摄入影响血糖稳态及盐排泄,侧重观察PPARδ介导的脂联素分泌对SGLT2产生作用及其对尿钠及尿糖排泄的影响及其机制。2、在糖尿病动物模型中观察高盐摄入对SGLT2作用的影响及其机制,并在临床糖尿病患者中验证,结果表明脂肪PPARδ在脂联素介导的肾脏SGLT2调节钠糖平衡中发挥关键作用。材料与方法:本研究包括两部分:1.验证高盐对尿钠排泄和葡萄糖稳态的影响,研究高盐致脂肪PPARδ激活后由脂联素介导的促进小鼠肾脏尿钠和葡萄糖排泄的分子机制,同时在小鼠模型中测试SGLT2的急性功能改变。2.在第一部分实验基础上,在db/db糖尿病动物模型中研究高盐摄入对SGLT2表达及功能的影响,并在临床糖尿病患者中分析血糖、脂联素、尿钠三者的关系。1.3T3-L1前脂肪细胞以及C57BL/6小鼠原代脂肪细胞的分组培养,免疫印迹检测PPAR各亚型的表达,并设立氯化钠和甘露醇梯度的渗透压浓度,作为对照观察PPARδ的表达变化。2.脂肪特异敲除PPARδ小鼠(Fabp4-PPARδflox/flox)模型构建,在高盐(8%氯化钠)和普食(0.4%氯化钠)喂养条件下,观察小鼠尿钠排泄的变化、脂联素的分泌及达格列净(特异性SGLT2抑制剂)干预后肾脏SGLT2表达的变化。3.Adn-/-小鼠注射外源性脂联素Acrp30,观察其迁移表达特性。4.Adn+/+和Adn-/-小鼠分组培养后,予以PPARδ激动剂,免疫印迹法检测肾周脂肪及肾脏皮质SGLT2、脂联素的表达,观察小鼠尿钠、尿糖排泄及糖耐量变化。5.高盐及普食喂养db/db糖尿病小鼠后,观察小鼠尿钠、尿糖排泄等改变,予以达格列净干预,检测小鼠肾脏SGLT2的表达,并观察小鼠24小时尿钠、尿糖排泄及血糖变化。6.收集糖尿病患者血浆样本,检测患者空腹血糖、糖化血红蛋白、血清脂联素、24小时尿钠,分析各指标之间的相关性。结果:1.高盐(8%盐浓度)培养下3T3-L1前脂肪细胞和C57BL/6小鼠原代脂肪细胞中PPARδ表达显著升高,氯化钠和甘露醇(渗透压对照)以浓度依赖的方式显著增加PPARδ的表达。2.与Fabp4-PPARδflox/flox小鼠相比,8%高盐摄入明显降低PPARδflox/flox小鼠的空腹血糖水平。高盐摄入显著增加Fabp4-PPARδflox/flox小鼠和PPARδflox/flox小鼠尿量和尿钠排泄以及血浆和肾周脂肪的钠含量,同时降低血浆醛固酮水平。高盐摄入显著降低PPARδflox/flox小鼠肾脏皮质SGLT2表达。达格列净显著增加高盐喂养下PPARδflox/flox小鼠尿钠及尿糖排泄。3.高盐摄入的PPARδflox/flox小鼠肾周脂肪和肾皮质中脂联素表达显著增加,血浆脂联素水平在PPARδflox/flox小鼠升高而在Fabp4-PPARδflox/flox小鼠中降低。予以PPARδ激动剂GW501516处理PPARδflox/flox小鼠原代培养的脂肪细胞致脂联素表达升高,而PPARδ拮抗剂GSK0660则降低其表达。4.染色质免疫共沉淀的结果表明,脂联素(Acrp30)干预后,SLC5A2基因启动子部位HNF-1a和sp-1的结合水平显著降低。5.GW501516显著提高Adn+/+小鼠血浆脂联素水平和肾周脂肪、肾皮质脂联素的表达,但对Adn-/-小鼠无此效应,口服葡萄糖灌胃后,GW501516促进尿钠和尿糖排泄的作用在Adn-/-小鼠中削弱了。GW501516干预后肾脏SGLT2的表达明显增强,而高盐对肾脏SGLT2表达的抑制作用在Adn-/-小鼠中消除了。6.高盐饮食不仅增加db/db小鼠的尿钠排泄,也增加尿量和尿糖。db/db小鼠肾脏SGLT2表达显著高于db/m小鼠,而高盐摄入可下调其表达。达格列净干预后,高盐喂养的db/db小鼠尿钠排泄和尿糖的升高幅度低于db/m小鼠。7.在糖尿病患者中,尿钠排泄与空腹血糖、糖化血红蛋白存在显著的负相关关系。此外,血糖或糖化血红蛋白控制良好的糖尿病患者的尿钠排泄更高,尿钠排泄量和血浆脂联素水平之间有明显的相关性。结论:1.脂肪组织PPARδ激活促进小鼠在高盐摄入条件下的尿钠和尿糖排泄增加,这与肾脏近端小管上SGLT2表达及功能抑制有关。脂肪组织PPARδ介导的脂联素在抑制肾脏SGLT2中起着至关重要的作用。2.在生理情况下,高盐摄入诱导的糖尿病小鼠尿钠排泄受损源于高糖导致的SGLT2活性增加。3.血糖控制不佳的2型糖尿病患者尿钠排泄减少,且糖尿病患者的血浆脂联素水平尿钠排泄密切相关。
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