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肝纤维化(Liver fibrosis)起因于肝脏的慢性损伤及细胞外基质(Extracellular matrix,ECM)蛋白的积累,是大多数慢性肝病的特征。肝纤维化一旦发展为肝硬化甚至肝癌,则无法逆转且无有效治疗措施。因此寻找肝纤维化的易感因素及阐明肝纤维化发生的机制,对于肝纤维化的预防及治疗具有重要意义。乙醇脱氢酶(Alcohol dehydrogenase,ADH)为机体的一相代谢酶,其在肝脏组织中表达最为丰富。ADH主要参与乙醇和视黄醇的代谢,此外也参与类固醇和脂肪酸等的代谢,在机体稳态中发挥着重要的作用。越来越多的研究显示ADH代谢活性的改变与疾病存在一定关系,譬如在肝癌、脑癌和肾癌等癌症中,患者血清及癌组织中均显示出更高的ADH活性。本实验室前期结果显示,与正常组织相比,人肝纤维化组织中ADH活性明显升高;且在大鼠肝纤维化模型中观察到ADH的初始活性与肝损伤的指标呈现良好的相关性。以上结果提示ADH参与肝纤维化的进程,但其参与肝纤维化的机制及抑制其活性肝纤维化是否改善有待进一步研究。视黄醇及其代谢产物对维持机体生命活动有重要意义,视黄醇主要经ADH代谢为视黄醛,进而被代谢为视黄酸,正常生理量的视黄醇和视黄酸是成年机体组织稳态所必须的,然而视黄醇代谢的改变可能是肝纤维化过程的途径之一。文献报道在四氯化碳(Carbon tetrachloride,CC14)诱导的纤维化动物模型中观察到视黄醇含量的降低,及其代谢产物视黄酸含量的升高。推测视黄醇的流失与ADH活性增高有关,其可能通过对视黄醇代谢的调节从而参与纤维化的进程。转化生长因子-β1(Transforming growth factor-betal,TGF-β1)在肝纤维化的发展中起着至关重要的作用。研究显示视黄醇的代谢物视黄酸能够诱导肝星状细胞的激活和TGF-β1的表达,从而加剧肝纤维化的发展。而TGF-β1可上调蛋白酶抑制剂如纤溶酶原激活物抑制剂-1(Plasminogen activator inhibitor type-1,PAI-1),并干扰基质金属蛋白酶(Matrix metalloproteinases,MMPs)的产生,影响ECM的降解,从而促进肝纤维化。本研究拟以四氯化碳(CC14)诱导的小鼠肝纤维化模型为研究对象,测定小鼠肝纤维化各个阶段的ADH活性,分析血清和肝匀浆中ADH活性与肝纤维化评分的相关性,并探讨ADH抑制剂4-甲基吡唑(4-Methylpyrazole,4-MP)对肝纤维化的保护作用。采用高效液相色谱(High performance liquid chromatography,HPLC)测定肝组织中视黄醇含量,Real-time PCR和Western-blot测定TGF-β1、PAI-1、MMP9因子的变化,初步探讨ADH参与肝纤维化的机制。方法本研究动物试验方案经郑州大学医学伦理委员会批准。1 ADH抑制剂4-甲基吡唑对肝纤维化模型的保护作用1.1 小鼠肝纤维化模型95只昆明小鼠随机分成4组,对照组、模型组、抑制剂组和4-MP组。对照组小鼠给予橄榄油(5 ml/kg,i.p.)一周两次;模型组小鼠给予CC14(20%CC145 ml/kg,i.p.)一周两次;抑制剂组小鼠在给予模型组相同处理的同时使用4-MP(100 mg/kg,i.p.)每周三次;4-MP 组小鼠仅给予 4-MP(100 mg/kg,i.p.)每周三次,模型共持续诱导9周。每周测定一次小鼠的体重。首次注射药物后的第3、6、9周处死动物,收集血液和肝组织样品,切取部分肝组织固定于4%的福尔马林中,剩余肝脏组织分装到冻存管中,血清和肝脏组织置于-80℃冰箱备用。1.2 小鼠肝组织病理染色将固定于4%福尔马林中的肝组织进行石蜡固定包埋并切片,后进行H&E和Masson染色,在光学显微镜下拍照,并参考Ishak评分标准,对肝组织进行纤维化分级,用以反映肝纤维化的严重程度。1.3 小鼠血清ALT、AST测定采用全自动生化分析仪测定小鼠血清中谷丙转氨酶(Alanine aminotransferase,ALT)及谷草转氨酶(Aspartate aminotransferase,AST)含量。1.4 小鼠ADH活性测定取出-80℃冰箱中的血清和肝组织,肝组织按照重量:体积=1:9比例制成10%的肝匀浆。采用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定肝匀浆蛋白浓度。ADH活性测定以对亚硝基二甲基苯胺(p-nitrosodimethylaniline,NDMA)作为底物,与血清(或肝匀浆)、甘氨酸-氢氧化钠缓冲液混合均匀,后加入正丁醇和NAD的混合液启动反应,使用多功能酶标仪在波长440nm下检测底物的吸光值。2 ADH参与肝纤维化的机制2.1 小鼠病理染色和ADH活性测定为研究ADH抑制剂使用时间对肝纤维化的影响,另取小鼠随机分成4组,对照组、模型组、抑制剂-1组小鼠给药同1.1。抑制剂-2组小鼠首次给予CC14三周后,开始给予4-MP进行干预。模型共诱导6周,模型结束后处死全部小鼠。留取血清及肝组织,进行病理染色及ADH活性的测定。2.2 肝组织中视黄醇测定取出-80℃冰箱中小鼠肝组织制成5%肝组织匀浆,采用正己烷对肝组织匀浆视黄醇进行萃取,HPLC-UV法测定其中视黄醇含量。2.3 TGF-β1、PAI-1 及 MMP9 的测定提取肝组织中总RNA及蛋白,采用Real-time PCR和Western-blot检测肝组织中肝纤维化相关因子TGF-β 1、PAI-1及MMP9的mRNA及蛋白表达水平。3 统计学分析使用SPSS 20.0和Prism 6.0对数据进行统计学分析和作图,使用t检验(两组数据)或单因素方差分析(多组数据)进行组间比较,相关性检验采用Pearson检验(正态分布数据)或Spearman检验(非正态分布数据)。P<0.05时视为有统计学意义。结果1 ADH抑制剂对肝纤维化的保护作用1.1 ADH抑制剂 4-MP的肝毒性血清ALT和AST水平及H&E和Masson染色结果显示单独使用4-MP(100mg/kg,i.p.)没有明显肝毒性。1.2 小鼠体重肝重的变化小鼠体重随时间逐渐增长,各组间体重无差异(P>0.05)。与对照组相比,在诱导模型的第3、6、9周模型组小鼠肝重比明显升高(P<0.01)。抑制剂组小鼠肝重比在第6周时与模型组相比明显降低(P<0.01)。1.3 小鼠的病理染色结果与对照组(0.00±0.00)相比,第3 周(3.13±1.17)、第6周(3.63±0.70)及第9周(3.25±0.43)模型组小鼠Ishak评分均显著升高(P<0.0001),结果表明成功建立了肝纤维化模型。第3周(3.33±0.82)抑制剂组小鼠Ishak评分与模型组无差异(P>0.05);第6周(1.78±1.03)和第9周(2.13±1.17)时,抑制剂组小鼠Ishak评分与模型组相比明显降低(P<0.001)。说明随着ADH抑制剂(4-MP)使用时间的延长,肝纤维化得到了改善,且Ishak评分显示在第6周时改善最为显著。Masson染色显示对照组小鼠肝组织未见明显胶原纤维增生;模型组可见大量汇管区门静脉与中央静脉周围有胶原纤维增生,多见桥接形成。第6周和第9周时抑制剂组表现为局部汇管区周围可见少量胶原纤维增生。1.4 小鼠的ALT、AST水平与对照组相比,模型组小鼠血清ALT、AST水平明显升高(P<0.0001)。抑制剂组和模型组之间无差异(P>0.05),结果表明ADH抑制剂(4-MP)未能改善CC14引起的ALT和AST的升高。1.5 纤维化模型过程中小鼠ADH活性的改变1.5.1 小鼠血清ADH活性自身对照发现,随着时间推移,对照组小鼠ADH活性无改变。与第0周(46.37±12.79 U/ml)血清ADH活性相比,模型组第3周(379.79±156.97 U/ml)、第6 周(198.77±57.23 U/ml)、第 9 周(253.10±82.69 U/ml)血清 ADH 活性显著升高(P<0.0001),第3周ADH活性最高。结果提示肝纤维化早期ADH活性最高。组间比较发现,模型组ADH活性远高于同时期对照组(P<0.0001)。结果表明在纤维化过程中ADH活性显著升高。抑制剂组血清ADH活性明显低于模型组(P<0.0001),与对照组ADH活性无差异,结果表明ADH抑制剂能够抑制肝纤维化过程中ADH活性的升高,并使其活性降低到正常水平。1.5.2 小鼠肝匀浆中ADH活性在诱导模型的第3周、第6周和第9周,与对照组小鼠肝匀浆中ADH活性(27.27±19.51 nmol/min/mg protein,21.79±10.65 nmol/min/mg protein,33.97±8.74 nmol/min/mg protein)相比,模型组小鼠肝匀浆中ADH活性为111.81±31.59 nmol/min/mg protein,76.96±27.92 nmol/min/mg protein 和 80.41±28.34 nmol/min/mg protein,分别升高了 4.1、3.5、2.4 倍(P<0.0001)。抑制剂组小鼠肝匀浆中 ADH 活性分别是 58.58±30.87 nmol/min/mg protein,33.68±10.76 nmol/min/mg protein 和 29.90±16.19 nmol/min/mg protein,与模型组相比明显降低(P<0.001),与对照组相比无差异(P>0.05)。1.5.3 小鼠血清和肝匀浆中ADH活性的相关性分析诱导模型的第3周、第6周和第9周,小鼠血清中ADH活性与其在肝匀浆中活性存在良好的相关性(P<0.0001),相关系数分别0.6307、0.5578和0.7035。1.6 小鼠ADH活性与肝纤维化评分的关系第3周、第6周及第9周小鼠血清和肝匀浆ADH活性与Ishak评分均呈正相关,相关系数在0.4693-0.7243之间(P<0.0001)。以上结果提示ADH活性越高,肝纤维化越严重。2 ADH参与肝纤维化的机制2.1 小鼠的H&E染色与1.3结果一致,抑制剂-1组Ishak评分与模型组相比明显降低(P<0.01),抑制剂-2组小鼠Ishak评分与模型组相比有降低的趋势但无统计学差异(P>0.05)。结果说明ADH抑制剂的早期使用对肝纤维化的改善更明显。2.2 小鼠肝组织中视黄醇含量的改变本研究中所采用的视黄醇测定方法专属性较高,标准曲线为C=0.0152A-0.0777(R2=0.9998),线性范围为0.39～9.38μg/ml,日间及日内变异,相对回收率和绝对回收率均符合生物样本测定要求。与对照组小鼠肝组织视黄醇含量(13.26±4.52 ng/mg liver)相比,模型组小鼠视黄醇含量(8.30±1.23 ng/mg liver)明显降低(P<0.01)。抑制剂-1组小鼠视黄醇含量(10.99±2.92 ng/mg liver)明显高于模型组(P<0.05)。抑制剂-2组小鼠视黄醇含量(10.02±4.23 ng/mg liver)较模型组有升高的趋势,但无统计学差异(P>0.05)。结果提示肝纤维化发展过程中伴随着视黄醇的流失,ADH抑制剂减缓了视黄醇的流失。2.3 小鼠ADH活性与肝组织视黄醇含量及肝纤维化评分的关系小鼠血清和肝匀浆中ADH活性均与肝纤维化评分呈正相关(P<0.0001),与肝组织中视黄醇含量呈负相关(P<0.05)。以上结果显示ADH活性越高,纤维化越严重,且ADH活性越高视黄醇含量越低,提示ADH活性增高可能通过调节视黄醇的代谢参与到肝纤维化过程中。2.4 小鼠 TGF-β1、PAI-1、MMP9 的变化模型组小鼠肝组织中TGF-β1、PAI-1和MMP9的mRNA和蛋白表达水平均高于对照组(P<0.001),抑制剂-1组中TGF-β1、PAI-1、MMP9表达与模型组相比明显降低(P<0.01)。抑制剂-2组中PAI-1、MMP9表达与模型组相比明显降低(P<0.01),TGF-β1无明显改变(P>0.05)。结果提示抑制ADH后可能通过影响TGF-β1、PAI-1和MMP9的表达来保护小鼠肝纤维化。结论1.在肝纤维化过程中ADH活性显著升高,其活性在肝纤维化早期阶段最高。2.血清及肝组织中ADH活性均与肝纤维化严重程度呈正相关。3.抑制ADH能够改善小鼠肝纤维化,其作用机制与抑制视黄醇的流失及调控TGF-β1、PAI-1、MMP9 因子有关。