【摘 要】
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目的:口腔鳞状细胞癌（oral squamous cell carcinoma,OSCC）是口腔颌面部最常见恶性肿瘤之一,尽管诊疗技术不断改善,却仍无法提高OSCC总体生存率。自噬通过维持细胞稳态,参与肿瘤进展的不同阶段,目前已有多种micro RNA（miRNA）参与自噬调控过程。miR-10b在多种肿瘤中发挥致癌作用,但miR-10b对OSCC细胞自噬的调控机制尚不清楚。本研究将探索OSCC中
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目的:口腔鳞状细胞癌（oral squamous cell carcinoma,OSCC）是口腔颌面部最常见恶性肿瘤之一,尽管诊疗技术不断改善,却仍无法提高OSCC总体生存率。自噬通过维持细胞稳态,参与肿瘤进展的不同阶段,目前已有多种micro RNA（miRNA）参与自噬调控过程。miR-10b在多种肿瘤中发挥致癌作用,但miR-10b对OSCC细胞自噬的调控机制尚不清楚。本研究将探索OSCC中miR-10b调控自噬的潜在机制。方法:1、通过RT-qPCR验证20对OSCC组织样本以及OSCC细胞系中miR-10b表达情况。2、通过转染micro RNA inhibitor和micro RNA mimics分别敲低和过表达miR-10b构建细胞模型,采用划痕及transwell实验检测miR-10b对OSCC细胞迁移及侵袭能力的影响。3、采用Western Blot、透射电镜及LC3双荧光腺病毒检测miR-10b对OSCC细胞自噬的影响。4、通过si RNA-ATG5抑制OSCC细胞中ATG5的表达,随后采用划痕及transwell实验观察抑制自噬后miR-10b对OSCC细胞迁移及侵袭能力的影响。5、利用生物信息学预测miR-10b下游潜在靶基因,并通过RT-qPCR进一步筛选,并通过双荧光素酶报告基因实验、Western Blot及免疫组化验证二者靶向关系。6、通过构建靶基因过表达质粒,结合划痕与transwell实验验证靶基因是否参与miR-10b对OSCC细胞迁移与侵袭过程。7、通过Western Blot、透射电镜及LC3双荧光腺病毒检测miR-10b是否可通过靶基因调控OSCC细胞自噬。结果:1、与癌旁组织相比,miR-10b在OSCC中显著高表达,同时miR-10b在OSCC细胞系SCC-15、TCA-8113、CAL-27、SCC-25中表达显著高于HOK细胞系,SCC-25中miR-10b表达最高用于后续细胞学实验。2、miR-10b inhibitor及mimics可有效在SCC-25细胞中敲低或过表达miR-10b,与对照组相比,抑制miR-10b表达会显著抑制SCC-25细胞迁移与侵袭能力,而过表达miR-10b会增强SCC-25细胞迁移与侵袭能力。3、抑制miR-10b会抑制SCC-25细胞自噬,过表达miR-10b会增强SCC-25细胞自噬。4、有效抑制ATG5后,过表达miR-10b对SCC-25细胞迁移与侵袭能力的促进作用将被抑制。5、通过分析Target Scan、miRDB、micro T＿CDS、EIMMo四个数据库,初步筛选出11个候选基因（RORA、CREB1、FIGN、SOBP、BDNF、TFAP2C、GATA6、BCL2L11、EBF2、HOXA3、CADM2）,随后实验进一步验证BCL2L11（Bim）是OSCC中miR-10b的直接靶点。6、采用Bim质粒在SCC-25细胞中上调Bim表达,发现SCC-25迁移与侵袭能力明显被抑制,当共转染miR-10b mimics后,可解除Bim对SCC-25细胞的抑制现象。7、过表达Bim可显著抑制SCC-25细胞自噬,共转染miR-10b mimics后可逆转Bim对细胞自噬的抑制作用。结论:miR-10b在OSCC中高表达,并通过OSCC细胞致癌自噬影响OSCC细胞迁移与侵袭。Bim作为OSCC细胞中miR-10b的直接靶标,参与miR-10b对自噬的调控过程。因此,miR-10b可作为治疗OSCC的潜在靶点。
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