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目的：以人肺腺癌A549细胞株作为研究对象(以下简称A549细胞),观察不同浓度中期因子蛋白(MK)干预A549。细胞株MMP-9的表达变化,探讨MK与MMP-9在肿瘤侵袭转移中是否相关,进一步探讨MK促进肺癌侵袭和转移的可能作用机制。方法：(1)MTT实验检测MK对A549细胞增殖的作用设空白对照组及2ng/mL、10ng/mL、50ng/mL和250ng/mL MK蛋白干预组,对照组仅加等量的1640培养液,各浓度复3孔。每隔2d更换含同样药物浓度的新鲜培养液,培养1-8天,加入MTT继续孵育4h后,用酶标仪测490nm吸光度(A)值。实验重复3次。(2)半定量逆转录-聚合酶联反应(RT-PCR)检测MMP-9mRNA的表达设对照组及2ng/mL、10ng/mL、50ng/mL和250ng/mL MK蛋白干预组。MK蛋白作用7天后收集细胞,抽提细胞总RNA,进行逆转录和PCR扩增。MMP-9扩增35个循环,其扩增片段长度为320bp,以GAPDH为内参照,扩增35个循环,长度450bp,实验重复3次。(3)免疫细胞化学实验检测MMP-9蛋白的表达取对数生长期的细胞,制成单细胞悬液后,以2500个/孔接种于24孔板上,每孔体积500ul。8h贴壁后加入含MK蛋白的1640培养基,使终浓度为2ng/mL、10ng/mL、50ng/mL和250ng/mL,对照组仅加等量的培养液。每组复3孔。干预满7天后,加入4%多聚甲醛固定。一抗稀释比例为1：100,4℃孵育过夜。然后按照免疫组化试剂盒规定的步骤进行,在200倍和400倍高倍镜下观察拍照,随机选摄5个视野／孔,用图像分析系统观察分析。结果：1.MTT检测MK对A549细胞促增殖的作用：用MTT法检测不同作用时间、不同作用浓度的MK干预A549细胞后的促增殖作用用不同浓度MK (0ng/ml、2ng/ml、10ng/ml、50ng/ml、250ng/ml)作用于A549细胞1-8d后,用MTT比色法测得的各组OD490nm值(A值),并绘制生长曲线图。不同浓度MK干预A549细胞后其生长曲线具有相同的趋势,各干预组自第3天起细胞的促增殖作用明显；与对照组比较,差异均具有统计学意义(P<0.05)；且随着干预时间的延长,促增殖作用更加明显,第8天达最高峰,说明MK干预对A549细胞的促增殖作用具有时间依赖性。经统计学结果分析比较不同浓度MK干预第7天对A549细胞的促增殖作用。对照组(Ong/ml)、2ng/mL、10ng/ml、50ng/mL和250ng/mLMK干预组的A549细胞的平均吸光度值(OD490)分别为0.732±0.021、0.770±0.047、0.794±0.073、0.833±0.045和0.716±0.069。结果提示,2ng/ml、10ng/ml与对照组比较,促增殖作用增强,差异无统计学意义(P>0.05);50ng/ml组与对照组、2ng/ml、10ng/m组比较,促增殖作用增强,差异有统计学意义(P<0.05);250ng/ml组与对照组及2ng/ml、10ng/ml比较,促增殖作用增强,差异均具有统计学意义(P<0.05),但与50ng/ml组比较有降低,具有统计学差异(P<0.05)。实验结果表明,MK50ng/ml为最佳干预浓度,且在一定浓度范围(Ong/ml、2ng/ml、10ng/ml、50ng/ml)内MK对A549细胞的促增殖作用具有量效关系。2.半定量逆转录-聚合酶联反应(RT-PCR)检测MMP-9mRNA表达：对照组和处理组结果经统计学分析,对照组(0ng/ml)、2ng/mL、 lOng/ml、50ng/mL和250ng/mL MK干预组的MMP-9/GAPDH光密度比值分别为0.3883±0.0332、0.2495±0.0072、0.2270±0.0119、0.1685±0.0028和0.1925±0.0077。与对照组比较,各浓度MK干预组MMP-9mRNA表达量均有降低(P<0.01),且随着MK浓度增加(Ong/ml、2ng/mL、10ng/ml和50ng/mL), MMP-9mRNA表达量呈逐渐增加的下降趋势,MK50ng/mL时MMP-9mRNA下降最明显,和2ng/mL和10ng/ml组间比较具有统计学意义(P<0.01)。 MK250ng/mL和2ng/mL和lOng/ml两组间也有统计学意义(P<0.05),250ng/ml虽较50ng/mL有所下降,但无统计学意义(P>0.05)；其余组间无差异。3.免疫细胞化学实验检测MMP-9蛋白表达：不同浓度MK作用A549细胞7天后的免疫细胞化学结果经统计学分析示,MK干预组MMP-9的蛋白表达较对照组比较都有下降,但下降不明显,均无统计学意义,即MK干预组和对照组细胞MMP-9蛋白表达无差异(P>0.05)。结论：(1)MK在一定的时间和浓度范围内可以促进A549细胞增殖。(2)MK可以降低A549细胞MMP-9mRNA的表达,在一定浓度范围内具有量效关系。(3)MK对A549细胞MMP-9蛋白表达影响不明显。(4)MK可能通过促增殖作用和下调MMP-9mRNA的表达参与调节肺癌的侵袭、转移。